论文摘要
卵巢功能早衰（Premature Ovarian Failure,POF）是常见的妇科内分泌疾病。近年来研究证实,由于该类患者卵巢分泌的雌激素减少,常可造成骨质疏松、脂质代谢紊乱、泌尿生殖道萎缩、心血管疾病等,致使患者的生活质量明显下降,给患者带来极大痛苦。现代医学认为卵巢功能早衰可能为多因素引起的综合征。包括遗传学因素、自身免疫性因素、酶学障碍、外界因素、感染因素等。中医认为卵巢功能早衰是以肾虚血亏为基本发病机制,后天保养不当,损伤过度也可导致肾阴天癸减少。其次,与心、肝、脾长期失和也相关。补肾健脾法是施艳秋教授在江苏省中医院妇科名老中医夏桂成教授“肾精亏耗是女性卵巢功能衰退的根本所在”这一治疗原则基础上拟定的。乌鳖颗粒则是以补肾健脾法组方（鳖甲、枸杞子、川断、茯苓、何首乌等中药）经现代制药技术研制出的纯中药医院制剂,临床用于治疗女性卵巢功能早衰。本研究首先采用卵巢摘除模型观察乌鳖颗粒对去势大鼠激素水平的影响,再从酶代谢、自身免疫、医源性等发病因素考虑采用D（+）-半乳糖代谢造模法、透明带免疫造模法、雷公藤、顺铂药物造模法来探讨卵巢功能早衰动物模型的制备以及乌鳖颗粒治疗卵巢功能早衰相关的作用机理。另外从中医肾虚及甲状腺激素紊乱导致卵巢早衰这一原因采用甲状腺片造模观察乌鳖颗粒对甲亢阴虚模型大鼠的影响。整个研究分为四部分内容：第一部分乌鳖颗粒急性毒性实验。结果未能测出LD5o;经口给药最大给药量实验结果表明：20只小鼠按148g/kg剂量灌胃给药后无明显毒性反应,2周内亦无死亡,该剂量为临床成人口服剂量的269.1倍（等效剂量的24.46倍）。提示：乌鳖颗粒临床用于治疗卵巢早衰是安全的。第二部分研究乌鳖颗粒对卵巢摘除大鼠激素水平的影响。方法：取雌性SD大鼠,行双侧卵巢摘除手术。手术后两周,将造模成功的大鼠随机分组。给药4周后,采用放免法检测血清E2、FSH、LH水平。并且利用TTC还原法测定大鼠阴道角化上皮细胞的多少。实验结果表明：卵巢摘除模型组大鼠分泌的阴道角化上皮细胞明显降低,血清雌二醇水平比假手术组明显降低（p<0.05,p<0.01）,但卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）水平与假手术组基本相当,无统计学意义。乌鳖颗粒各剂量组（11g/kg、5.5g/kg、2.75g/kg）大鼠分泌的阴道角化上皮细胞比模型组明显增加（p<0.05,p<0.01）。乌鳖颗粒大剂量组、中剂量组大鼠血清雌二醇水平比模型组明显增高（p<0.05,p<0.01）。乌鳖颗粒大剂量组、中剂量组FSH和LH水平与模型组比较呈下降趋势。提示：乌鳖颗粒能够增加卵巢摘除大鼠阴道角化上皮细胞的分泌,能够提高血清雌激素的水平,降低卵泡刺激素和黄体生成素的水平。乌鳖颗粒具有雌激素样作用,可以调节机体激素水平从而改善卵巢早衰的低雌激素、高促性腺激素的症状。第三部分研究乌鳖颗粒对不同方法诱导建立的卵巢早衰模型的影响。第一节中研究乌鳖颗粒对D（+）-半乳糖诱导建立的卵巢早衰小鼠的影响。按0.5m1/只·天的剂量每天颈背部皮下注射5%D（+）-半乳糖溶液,连续注射42天。从第11天开始,各组在皮下注射的同时给予相应药物,连续给药32天。通过检测动情周期、卵巢及子宫指数、血清雌二醇水平、卵巢及子宫的病理形态来观察乌鳖颗粒对D（+）-半乳糖诱导建立的卵巢早衰小鼠的影响。实验结果表明：乌鳖颗粒各剂量组（4.125g/kg）小鼠卵巢、子宫重量比模型组均有明显增加（p<0.05,p<0.01）。小鼠血清雌二醇水平比模型组有明显的升高（p<0.05,p<0.01）。乌鳖颗粒小鼠生长卵泡、成熟卵泡占卵泡总数的比例与模型组相比明显增加,闭锁卵泡明显减少（p<0.05,p<0.01）。乌鳖颗粒组子宫内膜厚度、子宫壁厚度比模型组明显增加,与模型组比较有显著性差异（p<0.01）。提示：乌鳖颗粒具有促进卵巢早衰动物卵巢、子宫的生长发育,改善卵巢早衰模型小鼠卵巢卵泡的发育水平和子宫组织结构功能,调节卵巢内分泌激素水平的作用。第二节中研究乌鳖颗粒对小鼠透明带多肽（ZP3）致卵巢早衰小鼠的影响。取雌性BALB/c小鼠,采用ZP3进行免疫建立卵巢早衰的模型。取造模成功的小鼠随机分组,在第三次免疫后6天给予相应药物,连续4周。通过检测动情周期、抗透明带抗体、脾脏CD4+/CD8+的比值、卵巢Fas、FasL蛋白的表达来观察乌鳖颗粒对ZP3致卵巢早衰小鼠的影响。实验结果表明：乌鳖颗粒大剂量组小鼠抗透明带抗体的浓度明显低于模型组（p<0.05）。乌鳖颗粒各剂量组小鼠脾脏CD4+/CD8+比值明显低于模型组（p<0.05,p<0.01）。乌鳖颗粒大剂量组、中剂量组小鼠Fas蛋白表达明显高于模型组（p<0.05,p<0.01）。乌鳖颗粒各剂量组Fas-L蛋白表达明显低于模型组（p<0.05,p<0.01）。脾脏、卵巢的组织形态学均有不同程度的改善。提示：乌鳖颗粒具有降低免疫性卵巢早衰小鼠外周血抗透明带抗体浓度的升高,调节CD4+/CD8+比值和Fas/FasL系统的作用。第三节中研究乌鳖颗粒对顺铂致卵巢早衰小鼠的影响。通过连续7天腹腔注射顺铂注射液（3.0mg/kg·d）建立小鼠卵巢早衰模型,造模同时连续2周给予乌鳖颗粒,通过检测动情周期、卵巢及子宫指数、血清雌二醇水平、卵巢的病理形态来观察乌鳖颗粒对顺铂所致卵巢早衰小鼠的影响。实验结果表明：乌鳖颗粒组小鼠卵巢、子宫重量比模型组均有明显增加（p<0.05,p<0.01）。乌鳖颗粒组小鼠血清雌二醇水平比模型组有明显的升高（p<0.05,p<0.01）。小鼠生长卵泡、成熟卵泡占卵泡总数的比例与模型组相比明显增加,闭锁卵泡明显减少（p<0.05,p<0.01）。提示：乌鳖颗粒具有促进卵巢早衰动物卵巢、子宫的生长发育,改善卵巢早衰模型小鼠卵巢卵泡的发育水平,调节卵巢内分泌激素水平的作用。第四节中研究乌鳖颗粒对雷公藤多苷片致卵巢早衰小鼠的影响。连续10周给予雷公藤多苷片（40mg/kg·d）建立卵巢早衰模型,从第五周开始,造模的同时给予乌鳖颗粒,通过检测动情周期、卵巢及子宫指数、血清雌二醇水平、卵巢的病理形态来观察乌鳖颗粒对雷公藤多苷片所致卵巢早衰小鼠的影响。实验结果表明：乌鳖颗粒各剂量组（16.5g/kg、8.25g/kg、4.125g/kg）小鼠卵巢、子宫重量比模型组均有明显增加（p<0.05,p<0.01）。乌鳖颗粒大、中剂量组小鼠血清雌二醇水平比模型组有明显的升高（p<0.05,p<0.01）。乌鳖颗粒大剂量组小鼠生长卵泡、成熟卵泡占卵泡总数的比例与模型组相比明显增加,闭锁卵泡明显减少（p<0.05,p<0.01）。提示：乌鳖颗粒具有促进卵巢早衰动物卵巢、子宫的生长发育,改善卵巢早衰模型小鼠卵巢卵泡的发育水平,调节卵巢内分泌激素水平的作用。第四部分研究乌鳖颗粒对甲亢阴虚模型大鼠的影响。取雌性SD大鼠随机分组。按4mg/只·天给予甲状腺片（除正常组外）,连续四周。第二周开始,在给予甲状腺片同时给予相应药物,连续三周。分别测定药前、药后7天、14天、28天时的血糖、心率、体重、摄食量、饮水量、尿量及体温。实验末取血清测定Cu和Zn比值。用放射免疫法测定T3、T4和TSH的含量。取甲状腺、肾上腺、胸腺、脾脏,计算各脏器指数。实验结果表明：乌鳖颗粒大剂量组大鼠甲状腺指数、脾脏指数、胸腺指数明显低于模型组大鼠（P<0.05,P<0.01）。乌鳖颗粒大剂量组大鼠肾上腺指数明显高于模型组大鼠（P<0.05）。乌鳖颗粒中剂量组大鼠甲状腺指数、脾脏指数明显低于模型组（P<0.05,P<0.01）。乌鳖颗粒小剂量组大鼠甲状腺指数明显低于模型组（P<0.01）。乌鳖颗粒大剂量组大鼠Cu的含量低于模型组,Zn的含量高于模型组,Cu/Zn比值与模型组比较具有显著性差异（p<0.05）。乌鳖颗粒各剂量组大鼠血清T3、T4的含量比模型组大鼠明显降低（p<0.01）。乌鳖颗粒大剂量组大鼠血清TSH的含量高于模型组,但与模型组比较均无统计学差异。提示：乌鳖颗粒对甲亢阴虚模型大鼠具有生津、滋阴,调节甲状腺激素的作用。结论：1、采用D（+）-半乳糖、雷公藤多苷、顺铂、小鼠透明带多肽诱导建立的不同卵巢功能早衰（POF）的模型是成功的,可作为有效的POF模型建立方法来评价相关药物的作用。2、乌鳖颗粒具有促进卵巢早衰动物卵巢、子宫的生长发育,改善卵巢子宫的组织形态,调节卵巢内分泌激素水平的作用。3、乌鳖颗粒具有降低免疫性卵巢早衰小鼠外周血抗透明带抗体浓度的升高,调节CD4+/CD8+比值和Fas/FasL系统的作用。4、乌鳖颗粒对甲亢阴虚模型大鼠具有生津、滋阴,调节甲状腺激素的作用。