猪链球菌2型强毒株05ZYH33二元信号转导系统CiaRH生物学功能研究

论文摘要

猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2）是一种呈全球分布的人兽共患病病原体。S. suis 2感染不仅可致猪急性败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎、关节炎及急性死亡,并且可通过伤口和呼吸道等传播途径,导致人的感染发病和死亡,对养猪业及相关从业人员均造成严重威胁。1998年和2005年我国江苏省和四川省分别暴发大规模S. suis 2感染疫情,患者出现链球菌中毒性休克综合征（Streptococcal toxic shock syndrome, STSS）,病情凶险,病死率高（62.7%～81.3%）,具体致病机制尚不清楚。二元信号转导系统（two-component signal transduction systems,TCSTS）是广泛存在于细菌中的调控单元,由膜上的组氨酸激酶（histidine kinase, HK）和胞内的反应调节因子（response regulator, RR）两部分组成,在致病菌感染宿主的过程中能调控多种毒力因子的表达以完成其致病过程。本课题组完成了S. suis 2强毒株05ZYH33（分离自STSS病人）的全基因组测序,并对基因组进行注释。结果显示,05ZYH33中存在11个TCSTS和5个孤儿反应调控因子,根据其编码基因所在阅读框的位置,选取其中一个TCSTS,命名为1094HK/1095RR,同源性比对发现1095RR与多种链球菌（肺炎链球菌、化脓链球菌、变形链球菌等）的CiaR氨基酸序列一致性高达80%以上。现已证实在肺炎链球菌中,CiaRH系统对维持细菌的完整性、感受性、毒性等生物活性发挥重要作用,而在猪链球菌中对于CiaRH的研究国内外尚未见报道。本课题以S. suis 2强毒株05ZYH33为对象,基于同源重组原理筛选获得ciaR基因缺失株,PCR分析及Southern杂交结果证实突变株构建成功。经过反复传代培养,证明敲除株可以稳定生长,壮观霉素抗性表型能够在敲除株中稳定表达。同时在相同条件下观察发现敲除株与野生株的菌落形态和溶血活性均无明显差别。通过绘制生长曲线,发现与野生株相比,敲除株在37℃和40℃其OD600值均明显降低;与40mmol/L过氧化氢共作用15min后涂板计数,突变株存活率明显低于野生株;不同pH值的培养基中培养,发现在pH5.0的酸性环境中突变株OD600值明显低于野生株;收集稳定期（OD600=0.6～0.8）细菌的菌体,置于含0.1% Triton X-100的液体中振荡培养诱导细菌自溶,每间隔1h检测发现突变株OD600值明显低于野生株;野生株与突变株对BALB/c小鼠攻毒（约1×109CFU/只）,各10只,两组16h后均死亡9只。综合以上实验结果说明敲除了05ZYH33菌株中的ciaR基因,细菌的生长减慢、繁殖能力减弱,抗氧化应激能力下降,在酸性环境中生长存活能力下降,0.1% Triton X-100诱导下自溶能力增强;但对小鼠的毒力未见明显差别。生物信息学分析发现CiaR蛋白为DNA结合蛋白,为了明确其调控的具体基因,较全面的诠释该调控系统的生物学功能,首先需要获得纯化的CiaR蛋白。本文通过原核表达系统体外表达了CiaR融合蛋白,将纯化的重组蛋白加免疫佐剂后免疫新西兰兔,获得高效价（1:204800）的兔抗CiaR多克隆抗体血清。Western blot结果显示,该血清可与CiaR重组蛋白发生特异性反应,说明该融合蛋白具有良好的免疫原性。所有上述工作,为进一步开展CiaR的调控机理研究奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 二元信号转导系统CiaRH 的发现、进化及分布
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 CiaRH 编码基因的一般特性
• 1.2.2 CiaRH 的同源性检索、多序列比对以及蛋白进化树的绘制
• 1.2.3 CiaRH 的跨膜区和信号肽预测
• 1.2.4 ciaR 基因在猪链球菌多种血清型中的分布情况
• 1.3 讨论
• 第二章 二元信号转导系统ciaR 基因敲除突变株的构建
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 重组敲除质粒pUC::ciaR 的鉴定
• 2.2.2 敲除突变株△ciaR 的PCR 鉴定
• 2.2.3 敲除突变株△ciaR 的Southern 杂交鉴定
• 2.3 讨论
• 第三章 二元信号转导系统ciaR 基因敲除突变株的生物学功能研究
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 敲除株的壮观霉素抗性基因稳定性观察
• 3.2.2 菌落形态和溶血活性的比较
• 3.2.3 显微形态结构的比较
• 3.2.4 37℃和40℃生长曲线比较
• 3.2.5 过氧化氢敏感实验
• 3.2.6 不同pH 值环境中的生长实验
• 3.2.7 Triton X-100 诱导的自溶实验
• 3.2.8 小鼠感染实验
• 3.3 讨论
• 第四章 二元信号转导系统CiaR 蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 重组表达载体pET32a::ciaR 的鉴定
• 4.2.2 CiaR 重组蛋白的表达及纯化
• 4.2.3 CiaR 重组蛋白的兔多抗血清抗体滴度检测
• 4.2.4 Western blot 分析
• 4.3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 综述 二元信号转导系统对细菌生物学功能的影响
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的论文
• 致谢