奶牛乳房炎链球菌的分离鉴定及抗原基因的克隆和表达

论文摘要

奶牛乳房炎是由各种病因引起的乳房炎症,它造成的经济损失非常巨大。尽管各国兽医工作者多年来对该病的预防与治疗研究付出了极大的努力,但仍无满意的结果,至今仍以抗生素治疗为主。由于抗生素残留和耐药菌株的出现造成奶品质下降和治疗困难,所以迫切需要研究新的预防与治疗方法。病原学调查表明,无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌是奶牛乳房炎的常见病原菌,但有关疫苗却少见报道且效果不理想,部分原因是因为链球菌血清型多缺乏共同保守性抗原。近几年,链球菌的一些保守性抗原被陆续发现,分别是停乳链球菌的MIG基因,无乳链球菌的SIP基因和无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌的GAPC基因,并认为它们可作为基因工程疫苗的候选抗原基因。本文克隆并表达了这些保守性抗原基因,为开发链球菌基因工程疫苗奠定基础。方法:本实验首先运用THB（Todd-Hewitt Broth）固体选择性培养基和色素试验培养基快速分离无乳链球菌和乳房链球菌,并结合生物梅里埃开发的VITEK全自动细菌鉴定仪进行准确鉴定。然后用PCR的方法分别从停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌的基因组DNA中扩增出MIG、SIP和各自的GAPC基因,并构建原核表达载体pET32a（+）-MIG、pET32a（+）-SIP和各自的pET32a（+）-GAPC。用BL21（DE3）/pET系统表达Trix-MIG、Trix-SIP和各自的Trix-GAPC融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物。结果:（1）分离鉴定到一株无乳链球菌和一株乳房链球菌。（2）PCR扩增产物经测序,证实与GenBank中MIG基因（AF354651）、和SIP基困（DQ650634）和无乳链球菌（CP000114）/停乳链球菌（AF375662）/乳房链球菌（AF421900）的GAPC基因序列同源性都在99%左右。SDS-PAGE显示,MIG、SIP和GAPC融合蛋白分别为89kDa、71kDa和55kDa。Western blot分析显示,MIG、SIP和GAPC融合蛋白可分别与停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌的多克隆抗血清发生特异性反应。结论:成功分离到一株无乳链球菌和一株乳房链球菌并克隆和表达了停乳链球菌MIG基因、无乳链球菌SIP基因和无乳链球菌/停乳链球菌/乳房链球菌GAPC基因,为基因工程疫苗的研制奠定一定的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写词表
• 第一章 文献综述
• 1 奶牛乳房炎的危害
• 2 奶牛乳房炎类型和临床症状
• 3 奶牛乳房炎的病因
• 4 奶牛乳房炎的防治
• 4.1 创造良好的饲养环境及挤奶卫生
• 4.2 奶牛乳房炎的药物治疗
• 4.3 乳房炎疫苗研究
• 参考文献
• 第二章 实验研究
• 实验一 无乳链球菌和乳房链球菌的分离鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 初步的分离鉴定
• 2.2 VITEK32型全自动细菌鉴定仪鉴定
• 3 讨论
• 参考文献
• 实验二 停乳链球菌MIG基因的克隆和原核表达
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 停乳链球菌基因组DNA的提取
• 1.3 引物设计与基因片段的PCR扩增
• 1.4 目的基因的克隆
• 1.5 原核表达载体的构建和测序
• 1.6 重组质粒pET-32a-MIG转入大肠杆菌表达菌
• 1.7 SDS—聚丙酰胺凝胶电泳
• 1.8 Western blot实验
• 2 结果
• 2.1 目的基因PCR扩增
• 2.2 重组质粒鉴定
• 2.3 测序结果
• 2.4 重组质粒在BL21（DE3）中表达产物的SDS-PAGE鉴定
• 2.5 Western blot检测
• 3 讨论
• 参考文献
• 实验三 无乳链球菌SIP基因的克隆和原核表达
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 无乳链球菌基因组DNA的提取
• 1.3 引物设计与基因片段的PCR扩增
• 1.4 目的基因的克隆
• 1.5 原核表达载体的构建和测序
• 1.6 熏组质粒pET-32a-MIG转入大肠杆菌表达菌
• 1.7 SDS—聚丙酰胺凝胶电泳
• 1.8 Western blot实验
• 2 结果
• 2.1 目的基因PCR扩增
• 2.2 重组质粒鉴定
• 2.3 测序结果
• 2.4 重组质粒在BL21（DE3）中表达产物的SDS-PAGE鉴定
• 2.5 Western blot检测
• 3 讨论
• 参考文献
• 实验四 无乳链球菌/停乳链球菌/乳房链球菌GAPC基因韵克隆和原核表达
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 无乳链球菌/停乳链球菌/乳房链球菌基因组DNA的提取
• 1.3 引物设计与基因片段的PCR扩增
• 1.4 目的基因的克隆
• 1.5 原核表达载体的构建和测序
• 1.6 重组质粒pET-32a-MIG转入大肠杆菌表达菌
• 1.7 SDS—聚丙酰胺凝胶电泳
• 1.8 Western blot实验
• 2 结果
• 2.1 目的基因PCR扩增
• 2.2 重组质粒鉴定
• 2.3 测序结果
• 2.4 无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌GAPC测序结果比对
• 2.5 重组质粒在BL21（DE3）中表达产物的SDS-PAGE鉴定
• 2.6 Western blot检测
• 3 讨论
• 参考文献
• 结论
• 致谢
• 附录
• 作者简介
• 导师评阅表