烟夜蛾气味受体基因和G蛋白α亚基基因的克隆与表达

论文摘要

嗅觉在昆虫的生存和种族繁衍过程中发挥着重要作用。昆虫对气味的识别过程非常复杂,气味分子与嗅觉神经元树突膜上气味受体的结合,参与了昆虫嗅觉识别的初始过程。昆虫气味受体被普遍认为是G蛋白偶联受体,而一些证据却不支持此观点。针对上述两种不同的观点,本研究对重要农业害虫烟夜蛾的气味受体基因、G蛋白α亚基基因以及两种基因之间的关系进行了研究,以期为昆虫识别气味分子机理的探明提供一些试验依据。主要研究内容包括:烟夜蛾气味受体和G蛋白α亚基基因的克隆、原核表达以及在烟夜蛾不同组织和发育期的表达;利用原位杂交和免疫组化方法研究两基因在烟夜蛾触角内的表达异同,初步分析两基因间的关系。主要研究结果如下:（1）利用RT-PCR和RACE-PCR方法扩增获得了烟夜蛾Or83b-like基因的全长cDNA（1946bp）,序列分析结果表明,该基因编码区全长1422bp,5′端非编码区长135bp,3′端非编码区长389bp;编码区推导表达473个氨基酸残基,预测所编码的蛋白质的分子量为53.51kD,等电点为8.73,预测氨基酸序列中含有7个跨膜区;此外,烟夜蛾Or83b类似受体与其他昆虫的Or83b家族受体的氨基酸序列有较高的一致性。证明获得的基因为昆虫的Or83b家族受体基因之一,暂命名为HassOr83b,此基因已在Genbank上登录,登录号为EU057178。（2）从烟夜蛾基因组中克隆出了一个长度为1202bp的HassOr83b基因片段,序列比对结果表明,该片段含有1087bp的内含子序列。此片段已在Genbank上登录,登录号为EU497670。（3）利用跨内含子引物和RT-PCR方法,研究了烟夜蛾HassOr83b基因在烟夜蛾不同发育期和组织内的表达情况。结果表明,HassOr83b基因在幼虫早期、幼虫晚期、蛹期、成虫期皆有表达,而在卵期没有表达;在雌雄成虫触角、下唇须和喙有表达,而在翅、足和去掉足、翅等附肢的躯干部没有表达。（4）利用原位杂交方法研究了HassOr83b基因在雄性烟夜蛾触角内的转录情况。结果表明,阳性标记出现在触角表皮下方的很多感觉细胞中,HassOr83b基因很可能在毛形感器下方的神经元胞体中表达。（5）利用RT-PCR方法,获得了烟夜蛾G蛋白αq亚基基因长度为1103bp的cDNA序列,其中编码区全长1062bp,5′端非编码区长21bp,3′端非编码区长20bp;该基因推导表达353个氨基酸残基,预测蛋白质的分子量为41.5kD,等电点为5.15。序列比对结果表明,烟夜蛾Gαq亚基与其他昆虫Gαq亚基的氨基酸序列有较高的一致性。此基因已在Genbank上登录,登录号为EU057176,该基因暂命名为HassGαq。（6）利用RT-PCR方法,研究了烟夜蛾HassGαq基因在烟夜蛾不同发育期和组织内的表达情况,结果表明,HassGαq基因在卵期、幼虫早期、幼虫晚期、蛹期和成虫期皆有表达,在触角、下唇须、喙、翅、足和躯干部也皆有表达。HassGαq基因在烟夜蛾体内为非组织特异性表达。（7）成功构建了HassGαq基因的原核融合表达载体,经过IPTG诱导以及SDS-PAGE和Western blot分析,结果显示原核表达产物的分子量约为66kD。由于HassGαq蛋白的预测分子量为41.5kD,GST标签的分子量为26kD,因此表达产物的大小与预测一致,试验结果证明融合蛋白得到了有效表达。（8）利用SDS-PAGE分离的目的条带作为抗原,免疫小鼠,获得了HassGαq蛋白的抗血清,Western blot分析结果表明,抗血清的特异性较差,而商品化的anti-Gq/11α抗血清的特异性较好。（9）利用anti-Gq/11α抗血清和免疫组化方法,对烟夜蛾HassGαq蛋白在雄性触角内的定位进行了研究,试验结果表明,HassGαq在毛形感器和锥形感器的基部以及感器腔中皆有表达。（10）通过比较HassOr83b基因和HassGαq蛋白在烟夜蛾触角内的表达情况（二者很可能皆在行使嗅觉功能的毛形感器下方的神经元胞体表达）,支持烟夜蛾嗅觉信号传导与G蛋白偶联的观点。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 昆虫嗅觉系统的结构与功能
• 1.1.1 昆虫周边嗅觉系统
• 1.1.1.1 昆虫嗅觉感受器
• 1.1.1.2 嗅觉相关蛋白及其功能
• 1.1.2 昆虫嗅觉中枢神经系统
• 1.2 昆虫气味受体研究进展
• 1.2.1 传统气味受体及其功能
• 1.2.2 Or83b 家族受体及其功能
• 1.2.3 Or83b 家族受体在昆虫体内的表达
• 1.3 昆虫G 蛋白研究进展
• 1.3.1 G 蛋白的亚基组成以及G 蛋白偶联信号传导系统
• 1.3.2 昆虫G 蛋白α亚基在昆虫体内的表达
• 1.3.2.1 G 蛋白α亚基在昆虫不同组织内的表达
• 1.3.2.2 G 蛋白α亚基在昆虫触角中的表达
• 1.4 昆虫气味受体与G 蛋白的关系
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 供试材料
• 3.1.1 供试昆虫
• 3.1.2 菌种及质粒
• 3.1.3 主要试剂及工具酶
• 3.1.4 试剂盒
• 3.1.5 缓冲溶液
• 3.1.6 SDS-PAGE 主要试剂
• 3.1.7 Western blot 主要试剂
• 3.1.8 培养基
• 3.1.9 原位杂交主要试剂
• 3.1.10 免疫组化主要试剂
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 核酸纯度和含量的测定
• 3.2.2 不同组织总RNA 的提取
• 3.2.3 反转录
• 3.2.4 烟夜蛾基因组DNA 的提取
• 3.2.5 引物和探针的设计与合成
• 3.2.5.1 引物的设计与合成
• 3.2.5.2 HassOr83b 基因探针的设计与合成
• 3.2.6 PCR 扩增
• 3.2.6.1 烟夜蛾HassOr83b cDNA 片段的扩增（内部扩增）
• 3.2.6.2 烟夜蛾HassOr83b cDNA 5′末端的扩增（5′RACE）
• 3.2.6.3 烟夜蛾HassOr83b cDNA 3′末端的扩增（3′RACE）
• 3.2.6.4 烟夜蛾HassOr83b 基因开放阅读框架（ORF）的扩增
• 3.2.6.5 烟夜蛾HassOr83b 基因部分内含子序列的扩增
• 3.2.6.6 烟夜蛾HassOr83b 在不同组织和发育期的表达
• 3.2.6.7 烟夜蛾HassGαq 基因cDNA 片段的扩增（内部扩增）
• 3.2.6.8 烟夜蛾HassGαq 基因cDNA 5′末端的扩增
• 3.2.6.9 烟夜蛾HassGαq cDNA 3′末端的扩增
• 3.2.6.10 烟夜蛾HassGαq ORF 的扩增
• 3.2.6.11 烟夜蛾HassGαq 在不同组织和发育期的表达
• 3.2.7 PCR 产物的琼脂糖电泳检测
• 3.2.8 PCR 产物的纯化
• 3.2.9 克隆载体与PCR 纯化产物的连接
• 3.2.10 感受态细胞的制备和质粒的转化
• 3.2.10.1 感受态细胞的制备
• 3.2.10.2 质粒向克隆菌株的转化
• 3.2.11 阳性克隆的筛选
• 3.2.12 DNA 序列测定
• 3.2.13 质粒DNA 提取
• 3.2.14 HassGαq 基因原核表达载体构建、转化及鉴定
• 3.2.14.1 原核表达载体的构建
• 3.2.14.2 重组表达载体的转化与鉴定
• 3.2.15 HassGαq 融合蛋白的原核表达
• 3.2.16 HassGαq 原核表达产物的SDS-PAGE 检测
• 3.2.17 HassGαq 原核表达产物的Western blot 分析
• 3.2.18 HassGαq 蛋白抗血清的制备
• 3.2.19 HassGαq 蛋白抗血清的效价测定和特异性检测
• 3.2.19.1 自制抗血清的效价测定
• 3.2.19.2 抗血清的特异性检测
• 3.2.20 雄性烟夜蛾成虫触角扫描电镜观察
• 3.2.21 HassOr83b 在触角表达的原位杂交分析
• 3.2.22 HassGαq 在触角表达的免疫组化分析
• 4 结果与分析
• 4.1 烟夜蛾HassOr83b 基因完整cDNA 序列
• 4.1.1 烟夜蛾HassOr83b 基因cDNA 片段的扩增（内部扩增）、克隆和序列测定
• 4.1.2 烟夜蛾HassOr83b 基因cDNA 末端的扩增、克隆和序列测定
• 4.1.3 烟夜蛾HassOr83b 基因完整cDNA 序列
• 4.2 烟夜蛾HassOr83b 基因cDNA 的序列分析
• 4.3 烟夜蛾HassOr83b 基因部分内含子的扩增、克隆和序列分析
• 4.4 烟夜蛾HassOr83b 基因在不同组织和发育期的表达
• 4.5 雄性烟夜蛾触角感器分布
• 4.6 烟夜蛾HassOr83b 基因在触角内的表达
• 4.7 烟夜蛾HassGαq 基因cDNA 序列的扩增和序列测定
• 4.8 烟夜蛾HassGαq 基因cDNA 序列分析
• 4.9 HassGαq 基因在烟夜蛾不同组织和发育期的表达
• 4.10 烟夜蛾HassGαq 基因的原核表达
• 4.11 烟夜蛾HassGαq 蛋白抗血清的制备、效价分析及特异性检测
• 4.11.1 烟夜蛾HassGαq 蛋白抗血清的制备和效价分析
• 4.11.2 烟夜蛾HassGαq 蛋白抗血清的特异性检测
• 4.12 烟夜蛾HassGαq 蛋白在触角内的表达
• 5 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.2 讨论
• 参考文献
• ABSTRACT