豆壳过氧化物酶的分离纯化、酶学性质及固定化研究

论文摘要

本研究主要针对大豆加工工业废弃物-豆壳进行综合利用,从中提取过氧化物酶,原料来源广泛,价格低廉,产物作用范围广,适用范围宽。首先选择目前应用最广的比色法测定豆壳过氧化物酶的活力,并根据酶活力测定过程中的影响因素：温度、pH值、愈创木酚、过氧化氢和酶浓度,分别对其进行单因素分析,并根据design expert软件进行优化设计,得出酶活力测定最优方案为：在60℃、pH6.0,愈创木酚和过氧化氢用量分别为24μl和19μl；其次,对酶液进行粗提取,将豆壳粉碎,按1：6加入磷酸缓冲液,在恒温震荡水浴锅中以30℃、150r/min条件下浸提24h,取出后八层纱布过滤,抽滤,4700r/min离心30min,取上清液作为酶原液,置于4℃冰箱内保存；取一定量酶原液加入10%硫酸铵粉末,边加边搅拌至硫酸铵完全溶解,置于4℃冰箱内静置过夜,次日取出,4000r/min离心15min取上清液,继续添加硫酸铵粉末至90%,边加边搅拌至硫酸铵完全溶解,置于4℃冰箱内静置过夜,次日取出,4000r/min离心15min留沉淀,以0.02M磷酸缓冲液做透析液,透析48h除盐,透析后酶液冷冻干燥48h得到酶粉；取0.05g豆壳过氧化物酶进行Sephadex G-75柱层析,收集酶活力较高的组分,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,得到豆壳过氧化物酶的分子量在40KD左右；对豆壳过氧化物酶进行酶学性质分析,测得豆壳过氧化物酶的最适温度为30℃,最适pH6.0,且在20-60℃、pH4-7范围内性质较为稳定,通过Lineweave Burk法采用双倒数作图得到豆壳过氧化物酶对愈创木酚和过氧化氢的表观Km值分别为1.94和0.41,由此得出,豆壳过氧化物酶的温度和pH值的作用范围较广,适用范围宽；对豆壳过氧化物酶进行固定化研究,先用Fe304吸附,再用明胶包埋,最后用戊二醛进行交联,测得酶液的活力,由此计算酶的包埋率,实验过程中对Fe304的用量、明胶浓度及交联时间进行了单因素分析,并用design expert软件优化实验方案,得到豆壳过氧化物酶最佳固定化方案为：Fe304用量为1g,明胶浓度为10%,交联时间为40min,在此条件下酶的包埋率达到86%。通过此研究,对豆壳过氧化物酶进行了提取、纯化,并进行了酶学性质和固定化分析,方案可行且为最优,不仅对豆壳进行了废物利用,而且为进一步的研究打下了坚实的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 大豆
• 1.2 豆壳过氧化物酶简介
• 1.3 酶的固定化
• 1.4 过氧化物酶的应用
• 第二章 豆壳过氧化物酶酶活力测定条件优化
• 2.1 试验材料与仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.3 各因素对酶活力测定的影响
• 2.4 优化酶活力测定方法
• 2.5 结果与讨论
• 2.6 本章小结
• 第三章 豆壳过氧化物酶的分离、提纯
• 3.1 试验材料与仪器设备
• 3.2 试验方法
• 3.3 结果分析
• 3.4 本章小结
• 第四章 豆壳过氧化物酶酶学性质分析
• 4.1 试验材料与仪器设备
• 4.2 试验方法
• 4.3 结果处理
• 4.4 本章小结
• 第五章 豆壳过氧化物酶固定化研究
• 5.1 试验材料和仪器设备
• 5.2 试验方法
• 5.3 结果讨论
• 5.4 本章小结
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 攻读硕士期间研究成果