TLR3和TLR7/8对小鼠妊娠子宫免疫功能的影响机制研究

论文摘要

妊娠免疫耐受机理属于生命科学的基本问题,这一机理的研究已经成为国内外学者关注的热点。母-胎免疫耐受的建立和维持需要多种细胞和分子参与,涉及到极其精细和复杂的机制。T细胞和NK细胞都是妊娠子宫中的主要免疫细胞群,通过分泌多种细胞因子调节母体对同种异基因的胚胎耐受。当遭受外来病毒入侵时,机体免疫系统不但要产生有效的免疫应答清除外来微生物,同时还要保证母-胎界面的免疫平衡不被破坏,使妊娠能顺利进行,此时需要更加精细复杂的免疫调控。目前母-胎免疫耐受机理尚未完全阐明,而病毒对母-胎界面免疫功能影响的相关研究有利于进一步揭示这一机理。先天识别受体被认为用于免疫细胞和非免疫细胞识别病毒相关分子和活化抗病毒等免疫反应。Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）属于先天性识别受体家族,能识别病毒、细菌等特有的分子,并活化抗病毒等抗感染反应。TLR3和TLR7/8均为TLR家族成员,参与机体的抗病毒等免疫过程。但TLR3和TLR7/8活化对母-胎界面免疫细胞的影响及作用机制尚未阐明。本研究借助于具有NK细胞缺陷的非肥胖型糖尿病（non-obese diabetic, NOD）小鼠模型,与正常非免疫缺陷小鼠进行对比性研究,进一步探讨T细胞和NK细胞在母-胎免疫耐受过程中的作用,并初步阐明TLR3和TLR7/8活化对母-胎界面免疫细胞的影响及作用机制。目的1.通过对NOD小鼠及BALB/c小鼠进行对比研究,探讨TLR3和TLR7/8的特异性激动剂poly（I:C）和R837单独以及联合作用对妊娠子宫母-胎界面免疫细胞功能状态以及妊娠结局的影响。2.借助于JNK MAPK和ERK MAPK两条信号传导通路的选择性抑制剂,进一步观察TLRs活化引起免疫效应的信号传导途径。材料与方法1.建立NOD×C57BL/6和BALB/c×C57BL/6两种同种异基因妊娠小鼠模型（雌性BALB/c或NOD小鼠与雄性C57BL/6小鼠同笼）,将实验分为NOD鼠组和BALB/c鼠组。各组根据处理方法不同再分别分为poly（I:C）组、R837组、混合物（联合刺激）组、PBS组和DMSO组。实验共计分为10组,每组分别获得10只孕鼠。分别于孕2.5天、4.5天及6.5天向孕鼠腹膜内注射poly（I:C）（溶于PBS,浓度为200ng/ml,注射剂量为200μl）、R837（溶于DMSO,浓度为20 ng/ml,注射剂量为200μl）,或poly（I:C）和R837的等体积混合物（40ng poly（I:C）溶于100μl PBS+4ngR837溶于100μl DMSO）,对照组注射同等体积的磷酸盐缓冲液（PBS）或二甲基亚砜（DMSO）。于孕12.5天处死小鼠并收集胎盘和蜕膜组织,计算胚胎吸收率。同时从NOD和BALB/c孕鼠收集的胎盘和蜕膜组织中分离单个核细胞,用流式细胞仪检测子宫CD45+细胞中细胞因子的表达情况。2.建立同样孕鼠模型,获得NOD孕鼠和BALB/c孕鼠。各组根据细胞的不同分别进一步分为CD3+组和CD49b+组,CD3+组和CD49b+组再根据刺激剂的不同分为Poly （I:C）组、R837组、两者联合刺激组、PBS组和DMSO组。实验共计分为20组。孕鼠于孕12.5天处死,在无菌条件下收集胎盘和蜕膜组织中的单个核细胞,经磁珠亲和细胞分选术（magnetic-affinity cell sorting, MACS）纯化获得CD3+和CD49b+细胞,并通过流式细胞术和碘化丙啶染色法鉴定纯化细胞的纯度和活力。纯化的CD3+和CD49b+细胞分别种植于24孔板中,分别于各孔加入Poly （I:C） （50μg/ml）、R837（10μg/ml）或者两者的等体积混合物,对照组在相同时间加入等体积的溶剂。培养6天后收集细胞,收集细胞前6小时于每孔加入布雷菲德菌素A （Brefeldin A） 10μg/ml,通过流式细胞仪检测各组CD3+和CD49b+细胞中TNF-α的阳性表达情况。3.建立同样的孕鼠模型,获得NOD孕鼠和BALB/c孕鼠。各组根据细胞不同进一步分为脾脏细胞组和胎盘细胞组（包括胎盘组织和底蜕膜组织细胞）,脾脏细胞组和胎盘细胞组根据加入的刺激剂再进-步分为poly（I:C）组、R837组、两者联合刺激组、PBS组和DMSO组。实验共计分为20组。在无菌条件下,将MACS技术纯化获得的孕12.5天雌鼠的脾脏和胎盘（包括胎盘及其附着处的蜕膜组织）组织中的CD49b+NK细胞,分别加入poly（I:C）（200ng/ml）、R837（100ng/ml）、或两者的等体积混合物,对照组加入同等体积的PBS或DMSO,共培养72小时后,通过标准51Cr释放试验比较两种TLRs激动剂对小鼠子宫NK细胞的毒性作用影响。每次实验重复3遍。4.建立同样的孕鼠模型,获得NOD孕鼠和BALB/c孕鼠。各组根据处理方法不同进一步分为SP600125、PD98059组和对照组,各组再根据加入刺激剂的不同分为poly（I:C）组、R837组和两者联合刺激组,实验共计分为18组。MACS技术纯化获得孕12.5天的NOD鼠胎盘CD3+细胞,与JNK激酶抑制剂SP600125（100μmmol/L）,或ERK1/2激酶抑制剂PD98059（100μmmol/L）共培养24小时,对照组加入等体积的DMSO。然后分别加入poly（I:C）（50μg/ml）、R837（10μg/ml）或者两者的等体积混合物。培养72小时后收集细胞,流式细胞仪检测CD3+细胞中TNF-α的阳性表达率,比较两种信号通路阻断剂对TLR3和TLR7/8的选择性抑制效应。结果1.体内实验经腹腔内注射poly（I:C）、R837或两者的混合物后,BALB/c和NOD孕鼠较溶剂对照组相比其胚胎吸收率均增加（P<0.01）。混合物联合刺激组较单独刺激组增加幅度更为明显（P<0.01）。而NOD小鼠较BALB/c小鼠的胚胎吸收率增加明显（PBS组P<0.05;在DMSO组、poly （I:C）组、R837组和联合刺激组P<0.01）。此外,TLRs激动剂刺激后,在子宫CD45+细胞中TNF-α和IFN-γ阳性细胞百分率均明显增加（P<0.05或P<0.01）。联合刺激较单独刺激后增加更为明显（P<0.01）,而IL-4、TGF-β和IL-10没有明显增加,但在BALB/c组表达水平较高。2.体外实验观察到,在BALB/c小鼠TLRs激动剂单独刺激后子宫CD3+TNF-α+和CD49b+TNF-α+细胞的百分率均增加（P<0.01）,联合刺激后增加更明显（P<0.01）。然而在NOD鼠,仅表现为CD3+TNF-α+细胞的百分率增加（P<0.01）,同样表现为联合刺激后增加更为显著（P<0.01）,但CD49b+TNF-α+细胞百分率的改变无统计学意义（P>0.05）。经流式细胞仪及碘化丙啶染色法鉴定纯化后细胞的纯度和活力分别超过97%和95%。3.通过标准51Cr释放试验检测NK细胞的细胞毒性水平,在BALB/c鼠脾脏和子宫NK细胞（uNK）在TLRs激动剂刺激后细胞毒性水平均增加,联合刺激后增加更明显,脾脏NK细胞毒性水平高于子宫NK细胞。然而在NOD鼠中分离的脾脏和子宫NK细胞仅呈现较低的细胞毒性,激动剂单独和联合刺激后脾脏组织中的NK细胞毒性水平轻微上调,而在子宫NK细胞未出现明显变化。4.通过SP600125处理组,TLRs激动剂刺激后的CD3+TNF-α+细胞百分率的增加被部分消除。但PD98059处理组,这种增加的趋势几乎完全被消除。在BALB/c鼠和NOD鼠均可观察到此现象（P<0.01或P<0.05）。同样出现联合刺激组CD3+TNF-α+细胞表达水平高于单独刺激组（P<0.05或P<0.01）。结论TLR3和TLR7/8被刺激活化后,主要通过上调Thl型和NK1型细胞表达TNF-α和IFN-γ等细胞因子,引起有效免疫应答,同时可引起胚胎丢失率的增高。但在NOD鼠则主要上调Thl型T细胞功能。ERK MAPK信号传导通路可能在TLR3和TLR7/8信号传导中起关键作用。TLR3和TLR7/8激动剂联合应用时具有叠加效应。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 前言
• 1.1 Toll样受体家族及功能特点
• 1.2 NOD小鼠动物模型的特点和选用NOD小鼠的依据
• 1.3 子宫NK细胞的功能特点及与妊娠耐受的关系
• 1.4 子宫T细胞的功能特点及与妊娠耐受的关系
• 1.5 本课题的研究内容与技术路线
• 第二章 TLRs对母-胎界面细胞因子的表达及妊娠结局的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 本章小结
• 第三章 体外实验观察TLRs对细胞因子表达的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 本章小结
• 第四章 NK细胞杀伤力检测
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 4.4 本章小结
• 第五章 TLR3和TLR7/8信号的选择性抑制效应
• 5.1 材料与方法
• 5.2 结果
• 5.3 讨论
• 5.4 本章小结
• 全文结论
• 参考文献
• 主要英文缩略词表
• 硕士研究生期间发表论文
• 致谢