论文摘要
以往的研究表明IL-6等细胞因子在大脑皮层和海马呈不对称分布。尽管脑不对称已为人们广泛深入的研究,但目前为止,细胞因子在皮质的不对称分布的细胞学来源仍然只是明确为来自神经胶质细胞。由于神经胶质细胞对炎症损伤的免疫功能在两侧大脑半球是不对称分布的,那么,细胞因子在皮质的不对称分布来自何种胶质细胞?带着这个问题,我们研究了在神经胶质细胞中数目最多,分布最广,担负了神经胶质细胞的大部分功能的星形胶质细胞。用LPS刺激体外培养的小鼠左、右侧皮质星形胶质细胞,分别从蛋白水平检测其分泌IL-6、TNF-α和IL-1-β的情况,实验分别对新生BALB/c小鼠左、右两侧大脑皮质的星形胶质细胞分组体外培养,LPS刺激24h,对照左、右侧无LPS刺激组。结果表明,LPS刺激后的左侧皮质星形胶质细胞分泌的培养上清中IL-6水平较右侧高,两者有显著性差别（p<0.05）。并对两侧有差别的因子IL-6用RT-PCR的方法来分析mRNA的表达情况。用半定量RT-PCR检测左、右两侧皮质星形胶质细胞分泌IL-6在基因水平上的不同。结果表明左侧皮质胶质细胞的IL-6mRNA水平显著高于右侧（p<0.05）。炎症因子作用下大脑皮质胶质细胞分泌的IL-6在蛋白和mRNA水平均有显著性差异。关于LPS的识别受体,目前多认为TLR4、CD14和MD-2分子三者构成了“LPS的识别受体复合体”,实验结果发现LPS刺激24h的小鼠左侧皮质星形胶质细胞分泌的IL-6水平显著高于右侧,那么左、右侧皮质星形胶质细胞对LPS的识别受体TLR4、CD14和MD-2分子是否也存在不对称性呢?带着这个问题,我们检测了小鼠左、右侧皮质星形胶质细胞经LPS诱导后TLR4/ MD-2、CD14分子的表达情况,发现CD14分子显著上调,右侧较左侧及无LPS刺激对照组有显著升高,p<0.01;而TLR4/ MD-2分子显著下调,与无LPS刺激对照组相比p<0.01。此外,应用人流感病毒H1N1和禽流感病毒H5N1感染人神经胶质细胞并对照LPS刺激组观察IL-6、TNF-a、IL-1β等细胞因子的表达情况,发现流感病毒和LPS刺激均可引起IL-6、TNF-a、IL-1β等炎性细胞因子mRNA的表达量增强。方法取新生BABL/c小鼠（<24 h）,断头处死。去除脑膜,分离左、右两侧大脑皮质,制备神经胶质细胞。纯化分离星形胶质细胞,免疫组化鉴定。LPS刺激24h,设对照组（不加LPS刺激）。ELISA法检测IL-6、TNF-a、IL-1的水平。应用Trizol试剂,提取星形胶质细胞总RNA,合成cDNA。PCR反应,产物经1.5%琼脂糖（AG ,agarose）凝胶电泳,在凝胶成像分析系统进行拍照和图像分析。LPS刺激的星形胶质细胞和对照组细胞分别加入FITC-Conjugated Anti-mouse CD14 2ul和PE-Conjugated Tol-like receptor 4/ MD-2,设同型对照管,流式细胞仪检测。流感病毒H1N1、H5N1亚型感染人皮质神经胶质细胞。Trizol作用后,收集至离心管中提取细胞总RNA,合成cDNA。PCR反应,PCR产物经1.5%琼脂糖（AG ,agarose）凝胶电泳,在凝胶成像分析系统进行拍照和图像分析。结果一、神经胶质细胞的形态学观察和星形胶质细胞的鉴定1.在倒置显微镜下,原代培养9d的皮质胶质细胞,胞突丰富,分支较多而形态呈多边形,主要包括:星形胶质细胞,小胶质细胞和少突胶质细胞。培养过程中给予定轨摇床重复摇晃培养瓶,将培养液移至新培养瓶中,10-20min小胶质细胞贴壁,弃上清,继续培养。第20d的皮质星形胶质细胞,在倒置显微镜下可见多数胞体呈星形,核大呈圆形或椭圆形,由胞体伸出许多呈放射状走行的突起形态。2.免疫细胞化学结果显示:细胞爬片上,凡胞浆被DAB染上棕黄色的细胞均为星形胶质细胞。随机对5个显微镜视野中细胞计数,发现98%以上的细胞胞浆GFAP蛋白表达阳性,而阴性对照片中,成纤维细胞的胞浆无此着色。表明经差速贴壁30min可以很好地去除成纤维细胞;给予定轨摇床重复摇晃培养瓶,可得到纯度很高的星形胶质细胞二、LPS对左、右两侧星形胶质细胞培养上清中IL-6含量的影响LPS作用24h后,左、右两侧星形胶质细胞培养上清中IL-6的含量明显升高,与对照组相比差异具有显著性（p<0.05）;左侧星形胶质细胞培养上清中IL-6显著高于右侧星形胶质细胞（p<0.05）;左、右两侧对照组相比,差异无显著性（p>0.05）。两侧皮质星形胶质细胞分泌的TNF-a较无LPS刺激的对照组有显著升高,左侧实验组高于左侧对照组,p<0.01;右侧实验组高于右侧对照组,p<0.05。左侧和右侧实验组未见显著差别,p>0.05。LPS刺激6h和24h的情况下,星形胶质细胞分泌的IL-1在实验组较对照组均有较大提高,但左侧和右侧实验组及对照组均无显著性差别,p>0.05。三、LPS对左右两侧星形胶质细胞IL-6 mRNA表达水平的影响以IL-6和β-actin光密度值的百分比来反映各组IL-6 mRNA的转录水平。RT-PCR结果显示:与control组相比,LPS刺激的左侧组及右侧组培养星形胶质细胞IL-6 mRNA的表达水平明显增高（p<0.05）,左侧组显著高于右侧组（p<0.05）。四、TLR4/MD-2在两侧皮质星形胶质细胞的表达无LPS刺激的对照组TLR4/MD-2的阳性细胞率较低,LPS刺激可下调表达TLR4/MD-2的阳性细胞率,两侧实验组阳性细胞率均下降,与无LPS刺激对照组相比p<0.01,两侧实验组膜受体TLR4/MD-2的下调无差别p=0.792。五、CD14在两侧皮质星形胶质细胞的表达LPS刺激右侧星形胶质细胞C14阳性细胞率较左侧及对照组有显著升高,p<0.01。表明LPS可上调膜受体CD14在皮质星形胶质细胞的表达,右侧皮质星形胶质细胞较左侧对LPS的刺激有更高的敏感性。六、流感病毒H1N1和H5N1亚型感染人神经胶质细胞LPS诱导和人流感病毒H1N1和禽流感病毒H5N1亚型感染人神经胶质细胞,均可促进炎性细胞因子IL-6、TNF-a和IL-1βmRNA的表达量增强。结论1.经差速贴壁30min可以很好地减少成纤维细胞的生长;小胶质细胞培养过程中加入少量星形胶质细胞后可促进小胶质细胞的生长、分化;给予定轨摇床重复摇晃培养瓶,可得到纯度较高的星形胶质细胞。2. LPS诱导24h,左侧星形胶质细胞释放IL-6水平显著高于右侧。左、右侧星形胶质细胞释放TNF-a均显著高于无LPS诱导组,但左、右侧无差别。释放IL-1β的含量也较无LPS诱导组明显升高,但无统计学意义,左、右侧无差别。3. LPS诱导的左侧星形胶质细胞IL-6 mRNA表达水平显著高于右侧。4.无LPS诱导的新生小鼠左、右侧星形胶质细胞在蛋白和mRNA水平均表达较低水平的IL-6。5. LPS诱导,可下调TLR4/MD-2在皮质星形胶质细胞的表达;右侧皮质星形胶质细胞的膜受体CD14水平上调显著高于左侧。6. LPS诱导、人流感病毒H1N1和禽流感病毒H5N1亚型感染人神经胶质细胞,均可促进炎性细胞因子IL-6、TNF-a和IL-1β的mRNA表达量增强。