鸡新城疫抗体免疫胶体金速测试纸条的研制及初步应用

论文摘要

新城疫（Newcastle Disease,ND）又名亚洲鸡瘟,是由副黏病毒属新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）引起的一种多病型的高度接触性传染病,主要侵害鸡、火鸡、其它家禽和野禽类,也可感染人,是一种世界范围内禽类的重要的通报疫病,也是我国养禽业几十年来长期坚持免疫预防的主要传染病之一。新城疫的流行,给全球养禽业造成了巨大的经济损失。目前,对于ND的诊断方法主要有病毒分离、血凝和血凝抑制试验、ELISA、RT-PCR等,但由于这些方法耗时冗长或需要特殊的仪器设备及技术人员,难以满足简便、实时快速诊断的要求。胶体金免疫层析方法是以条状纤维层析材料为固相载体,通过毛细管作用,以胶体金为示踪物来显示结果的一种新型的检测方法,具有操作简单、快捷,分析结果清楚、易于判断,且不需要任何仪器、成本低廉等优点,非常适用于现场检测及自动化检测分析。因此,该方法已在医学快速检测领域得到了迅猛发展,近年来已逐渐应用于动物医学领域的快速检测。本研究利用原核表达的HN重组蛋白,采用间接法胶体金免疫层析法的原理,在国内率先建立了鸡新城疫抗体免疫胶体金速测技术,取得了如下研究结果:1.新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶（aN）基因的亚克隆、表达及蛋白纯化设计一对分别带有BamHⅠ或XhoⅠ酶切位点的引物,利用PCR以及亚克隆的方法,从本室保存的表达质粒pGEX-KG-HN克隆出一段新城疫病毒La Sota系缺失胞质区、跨膜区的HN基因,将扩增产物克隆进pMD18-T载体,经限制性酶切鉴定,得到大小约1600bp的基因。再将其克隆到pGEX-6p-1中,与GST蛋白融合表达,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,共表达两种融合蛋白,分子量分别为88KD和58KD,Western blot印迹表明两种表达蛋白均具有较好的免疫反应活性。生物信息软件分析,HN-GST融合蛋白是疏水性蛋白,理论pI值为9.9。表达蛋白经亲和层析方法纯化得到纯度较高的HN-GST融合蛋白。2.鸡新城疫抗体免疫胶体金速测试纸条的研制及其初步应用采用柠檬酸三钠还原法,确立了20nm胶体金的制备条件;并利用制备好的胶体金,优化了鼠抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的标记条件:单抗的最佳标记pH为8.0,最适标记量为12μg/mL。以纯化的HN-GST融合蛋白和兔抗鼠IgG分别作为检测线和质控线捕获试剂,以金标抗鸡IgG Fc段单克隆抗体为探针,初步建立了检测鸡新城疫病毒血清抗体的速测胶体金速测试纸条。重组HN-GST融合蛋白的最佳喷膜浓度为400μg/mL,兔抗鼠IgG的最佳喷膜浓度为1mg/mL,该试纸条与禽流感H5亚型、禽流感H9亚型、鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊、鸡毒霉形体、滑液霉形体等阳性血清均无交叉反应,灵敏度比HI方法低一个滴度,该方法重复性好,与HI方法符合率为96.9%,结果可在10～15min内判定。用该试纸条检测了湖北、河南等地的150份被检鸡血清,总阳性率为84.7%。试验表明:该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好、快速等优点,可用于鸡新城疫血清抗体水平的快速监测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词（Abbreviation）
• 第一章 文献综述
• 1 新城疫研究进展
• 1.1 新城疫流行病学特点及现状
• 1.2 新城疫的病原学
• 1.3 新城疫病毒HN蛋白的研究进展
• 1.3.1 HN核苷酸序列
• 1.3.2 HN蛋白的结构
• 1.3.3 HN蛋白的糖基化
• 1.3.4 HN蛋白的半胱氨酸残基
• 1.3.5 HN蛋白的功能
• 1.3.6 HN蛋白的应用
• 1.4 新城疫抗原抗体检测方法的研究进展
• 1.4.1 病毒的分离鉴定
• 1.4.2 血清学方法检测
• 1.4.3 分子生物学诊断技术
• 1.5 新城疫的预防和控制
• 2 胶体金免疫层析研究进展
• 2.1 胶体金的特性及制备
• 2.1.1 化学还原法
• 2.1.2 光化学还原法
• 2.1.3 真空蒸镀法
• 2.1.4 辐射还原法
• 2.2 胶体金质量鉴定
• 2.3 免疫胶体金的制备原理及制备方法
• 2.3.1 标记pH
• 2.3.2 蛋白质离子含量及标记量
• 2.4 金标抗体复合物的纯化
• 2.5 胶体金免疫层析试纸条的结构和检测基本原理
• 2.5.1 间接法反应
• 2.5.2 竞争抑制反应
• 2.5.3 双抗体夹心法
• 2.6 胶体金免疫层析方法的应用
• 2.6.1 在抗体检测中的应用
• 2.6.2 在抗原检测方面的应用
• 2.6.3 在小分子化合物检测方面的应用
• 3 本研究的目的和意义
• 第二章 新城疫病毒HN基因的亚克隆、表达
• 1 研究目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 质粒及菌株
• 2.1.2 酶及主要试剂
• Trizol购自Omega公司。
• 2.1.3 酶标抗体
• 2.1.4 主要溶液的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 引物
• 2.2.2 PCR反应体系
• 2.2.3 PCR产物回收
• 2.2.4 PCR回收产物与pMD18-T连接
• 2.2.5 感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 2.2.6 连接产物的转化
• 2.2.7 质粒的制备
• 2.2.8 质粒pMD18-T-HN酶切鉴定
• 2.2.9 质粒pMD18-T-HN和表达载体pGEX-6P-1双酶切、回收
• 2.2.10 pGEX-6P-1-HN表达质粒的构建
• 2.2.11 诱导表达及HN蛋白免疫活性鉴定
• 2.2.12 诱导表达条件的优化
• 2.2.13 HN-GST蛋白特征分析
• 2.2.14 HN-GST融合蛋白的纯化
• 3 结果与分析
• 3.1 PCR扩增结果
• 3.2 克隆载体的构建和鉴定
• 3.3 表达载体的构建和鉴定
• 3.4 表达菌诱导后表达分析
• 3.5 表达条件的优化
• 3.6 蛋白的免疫活性检测
• 3.7 HN-GST蛋白特征分析
• 3.8 HN-GST蛋白的纯化
• 3.8.1 HN-GST包涵体纯化
• 3.8.2 可溶性HN-GST蛋白纯化
• 4 讨论
• 4.1 蛋白的表达和表达条件优化
• 4.2 HN蛋白的表达形式
• 4.3 蛋白的纯化
• 4.3.1 包涵体的纯化
• 4.3.2 可溶性蛋白纯化
• 5 结论
• 第三章 鸡新城疫抗体免疫胶体金速测试剂条的研制及初步应用
• 1 研究目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 仪器
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 溶液的配制
• 2.1.4 抗体、层析材料、血清
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 抗鸡IgG Fc单克隆抗体腹水的生产及生产
• 2.2.2 胶体金的制备
• 2.2.3 胶体金质量鉴定
• 2.2.4 抗鸡IgG Fc单克隆抗体的胶体金标记条件
• 2.2.5 胶体金标记抗体的制备与纯化
• 2.2.6 试纸条检测体系的组成
• 2.2.7 试纸条各种条件的筛选
• 2.2.8 样品处理方法
• 2.2.9 样品检测方法
• 2.2.10 鸡新城疫抗体免疫胶体金速测试纸条的性能测试
• 2.2.11 试纸条的临床应用
• 3 实验结果
• 3.1 抗鸡IgG Fc单克隆抗体的制备与纯化
• 3.2 胶体金的制备
• 3.3 抗鸡IgG Fc单克隆抗体的胶体金标记条件
• 3.3.1 金标鼠抗鸡IgG Fc单克隆抗体单抗的最佳标记pH
• 3.3.2 金标鼠抗鸡IgG Fc单克隆抗体单抗的最佳标记浓度
• 3.4 金标单抗的制备与纯化
• 3.5 封闭液的选择
• 3.6 HN蛋白的最佳喷膜浓度
• 3.7 兔抗鼠IgG喷膜浓度的选择
• 3.8 标准阴阳性对照确定
• 3.9 鸡新城疫抗体免疫胶体金速测试纸条的性能测试
• 3.9.1 特异性试验
• 3.9.2 灵敏度试验
• 3.9.3 重复性试验
• 3.9.4 保存期试验
• 3.10 临床检测结果
• 4 讨论
• 4.1 胶体金的制备与保存
• 4.2 胶体金—蛋白复合物的制备与纯化
• 4.3 封闭液的优化
• 4.4 HN蛋白包被量的优化
• 4.5 鸡新城疫抗体免疫胶体金速测试纸条的保存期问题
• 4.6 与同类试剂条的对比
• 4.7 胶体金免疫层析法的发展方向
• 5 结论
• 参考文献:
• 致谢