功能性消化不良患者多巴胺D2受体基因多态性与多潘立酮疗效关系的研究

论文摘要

目的功能性消化不良（Functional dyspepsia,FD）是指具有餐后饱胀不适、早饱、上腹痛或上腹烧灼感，经检查排除引起这些症状的器质性疾病的一组临床综合征，罗马Ⅲ标准将其分为餐后不适综合征和上腹疼痛综合征。FD是临床上最常见的一种功能性胃肠病。目前FD的病因及发病机制尚未完全明确，目前认为与胃肠运动功能障碍如空腹时胃运动障碍、餐后胃内食物分布异常、胃窦—幽门—十二指肠协调运动异常和胃排空延迟等机制有关。FD的治疗尚无特效药物与方法，以个体化对症治疗为主。目前治疗FD的药物包括促胃肠动力药、抑酸药、胃黏膜保护药、幽门螺杆菌（Hp）感染的根治、抗抑郁焦虑药物等。就促胃肠动力药而言，多巴胺受体拮抗药仍然是治疗功能性消化不良的主要药物，代表药物为多潘立酮，它选择性阻断多巴胺2（DA2）受体、主要作用于周围神经系统。由于DA2受体也同样是胃肠道的主要受体，因此DA2受体拮抗剂可减少多巴胺介导的胃平滑肌松弛，从而能增加消化道的动力。但是，在临床上却存在多潘立酮对一些FD患者具有良好的治疗作用，而对另外一部分FD患者却治疗效果不佳甚至完全无效的现象。此外，既往关于对功能性消化不良治疗效果的判断方法，已有许多临床研究，但这些方法存在费时，不经济，患者依从性差或不实用等缺点，因此探索一个较为简便、安全、经济、实用、依从性较佳的检测判断指标成为临床上一个比较实在的任务，本研究试图应用FD临床症状积分评估结合实时超声下观察胃窦收缩指标来判断多潘立酮的治疗效果，从而总结该方法的可行性及实用性。在确定多潘立酮治疗有效组及无效组之后，本研究采用操作相对简单，价格相对经济的基于连接酶链反应的单核苷酸多态（SNP）分型技术对二组FD患者多巴胺D2受体基因141C Ins／Del、A-241G、TaqI多态性研究，从而探讨FD患者多巴胺D2受体基因多态性与多潘立酮疗效的关系。材料与方法1．临床病例资料2006年6月至2007年6月浙医一院消化科就诊的参考罗马Ⅲ标准的FD患者，并符合以下入选标准：①年龄在18～65岁；②具有早饱或上腹胀症状，持续4周以上，可伴有或不伴有恶心、呕吐、上腹部疼痛、烧心、反酸、食欲不振、嗳气等症状；③试验前4周内经胃镜或胃肠钡餐检查排除胃肠肿瘤、消化性溃疡等器质性疾病，并行B超、血液生化检查排除肝、胆、胰系统疾病；④试验前72小时内停用影响本试验的抗胆碱能药物、解痉药和其他胃肠促动力药。2．给药途径所有患者给予多潘立酮片（丽珠医药集团生产，国药准字XF20010157）每餐前10mg，一日三次，共治疗4周。3．观察项目及指标3．1临床症状积分评分项目治疗前后记录早饱、上腹部饱胀、恶心、呕吐、上腹部疼痛、烧心、反酸、食欲不振、嗳气症状。3．2症状积分评分判断标准0分：无症状；1分：症状轻微，稍加注意感觉有症状；2分：症状明显，但不影响工作；3分：症状严重，影响工作。由于早饱及上腹部饱胀为功能性消化不良的主要症状，因此在计算症状积分时予以加倍计算。根据以上方法，计算出治疗前后的疗效总积分及总症状改善率。总症状改善率（％）=（治疗前总症状积分-治疗后总症状积分）／治疗前总症状积分×100％。参照以往文献经验，本研究确定总症状改善率60％以上而且治疗后，每个治疗前所具有的症状至少达到以下有效级以上的治疗效果的患者被认为是对多潘立酮治疗有效患者。反之，治疗后，治疗前所具有的症状加重或无变化的或未达到以上标准的患者被认为是对多潘立酮治疗无效患者。3．3治疗效果参照具体见下①痊愈，治疗后症状完全消失；②显效，治疗后症状改善2个等级但未完全消失；③有效，治疗后症状改善1个等级但未完全消失；④无效，治疗后症状加重或无变化。3．4．病例确定根据以上方法在所有接受多潘立酮治疗的FD病例中随机选出有效组74例，其中男21例，女53例，平均年龄为41．50±9．80。无效组73例，其中男23例，女50例，平均年龄41．30±11．20。4．实时超声胃排空检测方法及各项指标的确定4．1 S0：检查前3天停服胃肠动力药，当天禁食、禁饮12小时。受试者坐姿，取上腹部正中线附近纵切面，当腹主动脉、肠系膜上静脉、胃窦显示于同一切面时，停顿，用电子尺构画胃窦壁内层。即可显示出空腹胃窦面积（S0）。4．2△S：口服10％葡萄糖500ml作为试餐，37℃左右，5分钟内饮完。分别于即刻，连续6次测量由于胃窦收缩、舒张所引起的各时段胃窦面积，以后者减去前者，取平均值，代表平均胃窦收缩幅度△S；4．3F：连续计算4分钟内胃窦收缩次数；以平均每分钟胃窦收缩次数代表胃窦收缩频率F；4．4胃窦运动指数MI=△S×F：根据以往文献报道，实时胃B超排空检测中的胃窦运动指数MI能比较准确地反映胃排空的情况，故本实验参照了这个指标。5．141C Ins／Del、A-241G、TaqI的SNP位点确定。6．引物和探针6．1引物6．2探针7．LDR-SNP操作流程7．1 Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。7．2试剂盒配置总DNA抽提试剂盒为AXYGEN公司的AxyPrep-96全血基因组DNA试剂盒。7．3酶及其它试剂（1） Qiagen hotstar Taq酶体系(酶5u／ul，buffer，Q-solution,Mg2+)。（2） 10M NaOH：取40gNaOH于灭RNase处理的烧杯，加入约70ml无RNase的ddH2O，充分搅拌溶解，定容到100ml，4℃保存。（3） 1MTris-HCl（PH8．0）：取12．1gTris于灭RNase处理的烧杯，加入约80ml无RNase的ddH2O，充分搅拌溶解，浓盐酸调PH8．0，定容到100ml，4℃保存。（4） 0．5M EDTA（PH8．0）：取18．61gEDTA于灭RNase处理的烧杯，加入约70ml无RNase的ddH2O，充分搅拌溶解，用10M NaOH调PH8．0，定容到100ml，4℃保存。（5） TE缓冲液：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH8．0，4℃保存。（6） 75％乙醇：取新开瓶无水乙醇75ml，加入经过灭RNase处理的试剂瓶，加入ddH2O25ml，4℃保存。（7） 5×上样缓冲液：溴酚兰0．125g，32g甘油，灭菌水定容至50ml。（8） EB（10mg／ml）：50mgEB，加DEPC水5ml，分装成0．5ml的包装，避光保存。（9） 5×TBE：Tris54g，硼酸27．5g，20ml 0．5mol／L EDTA（pH8．0），定容至1000ml。7．4基因组DNA抽提0．8％琼脂糖凝胶，100-150V电泳检测，标化至50ng／L。7．5基因分型7．5．1基因组DNAPCR反应7．5．2总DNA浓度、纯度、完整性的检测用0．8％的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。称取0．8g琼脂粉，加入10ml 5×TBE缓冲液，加dd-H2O至100ml，微波炉融化后，冷却至约70℃（置水浴中），加入3μl 10mg／ml EB，摇匀后倒胶，冷却20min，凝固后拨掉梳子，加入0．5×TBE缓冲液没过胶面。取DNA样品10μl加入1μl 5×上样缓冲液，全部样品加于样品孔中，120V电泳20-30min，凝胶成像观察结果。7．5．3连接酶检测反应对SNP多态性的研究7．5．3．1 PCR扩增SNP位点所在片段1)按照下表准备PCR Master Mix（20uL体系）在1．5mleppendorf离心管中分别加入200ul PCR-buffer（10×），60ulMg2+（100mM）,200ul dNTP（20mM／each）,20ulTaq酶（5U／ul），400ul Q-solution（4×），40ul primer（5pM）,最后加入980ul去离子水。充分混匀后离心，再取19ul分装在200ul的PCR反应管中，最后再加入1ul基因组DNA。2)在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600上设置如下程序：95℃变性15min，35个循环，每个循环有3个温度，94℃30ses，59℃1min，72℃1min，最后在72℃延伸7min．将PCR反应管放入PCR仪进行反应。3)反应结束后，取2μl反应产物在3．0％琼脂糖胶，0．5×TBE中电泳，检测反应是否成功。4)剩余样品保存于-20℃。7．5．3．2 PCR产物的连接酶检测反应1)在PCR扩增产物中加入等体积ddH2O稀释，作为连接反应的模板。2)按照下表进行连接反应Mix（10ul体系）在1．5ml eppendorf离心管中分别加入100ul buffer（10×），100ul ProbeMix,5ul连接酶，695ul去离子水。充分混匀后离心，再取9ul分装在200ul的PCR反应管中；最后再加入1ul PCR反应产物。3)在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600上设置如下程序：95℃变性2min，35个循环，每个循环有2个温度，94℃30sec，60℃2min。将PCR反应管放入PCR仪进行连接反应。4)各取1μl LDR连接产物与1μl ABI GS-500ROX荧光标记分子量标准和1μl去离子甲酰胺上样液混合，95℃加热变性2分钟，冰中骤冷，于5％聚丙烯酰胺和5mol／L尿素中3000V电泳2．5小时，应用GENESCANTM672软件进行数据收集、泳道线校正、迁移片段大小测量和校正内在分子量标准；应用Genemapper软件进行数据分析和基因分型。5)剩余样品保存于-20℃。8．Genemapper数据分析Genemapper进行数据分析，进行各位点的分型截图。1．FD患者临床症状积分评估结合实时超声胃排空确定多潘立酮有效组及无效组的结果：临床症状积分评估所得的多潘立酮治疗有效组74例，其中男21例，女53例，平均年龄为41．50±9．80。无效组73例，其中男23例，女50例，平均年龄41．30±11．20。经过实时超声排空检测，结果显示，在有效组中，胃窦进液体餐后由胃窦舒张及收缩引起的胃窦面积变化值△S显示出明显的变化，其中治疗前为416．180±22．093，而治疗后为515．419±21．606，统计结果有非常显著性差异，P<0．01。同样胃窦的收缩频率F治疗前为2．030±0．226，治疗后为2．737±0．268，也显示出收缩明显加强，统计学也有非常显著意义，P<0．01。另外，本研究中非常重要的一个指标胃窦运动指数MI也出现了明显的变化，治疗前为847．061±119．978，治疗后却高达1410．922±154．833，有非常显著的统计学意义，P<0．01。而在无效组患者中治疗前后△S分别为416．269±23．046、416．838±20．294，胃窦的收缩频率F分别为2．065±0．224、2．038±0．194，胃窦运动指数MI分别为859．931±107．763、850．141±97．956。经统计学统计，均无明显统计学意义，P>0．05，再次确认临床症状积分评估的结果。2．有效组及无效组应用LDR-SNP技术检测多巴胺D2受体基因141CIns／Del、A-241G、TaqI多态性结果：2．1 DRD2-141C Ins／Del位点分型，在多潘立酮有效组患者中，多态基因型并无明显差别，二组基因型“C”型、“C／—”型及“—”型的频率分别为79．73％，17．57％，2．70％，在无效组患者中，以上基因型频率分别为79．45％，19．18％，1．37％，二组经精确概率法卡方检验，无统计学意义，P>0．05。而且，等位基因频率也无明显差别，有效组等位基因频率为88．51％，11．49％，无效组等位基因频率分别为89．04％，10．96％，经Pearson卡方检验，P>0．05。2．2 D2受体基因启动子A-241G位点分型，二组多态性基因型频率及等位基因频率均无明显差异，有效组的多态性基因型频率“A”型、“A／G”型及“G”型分别为58．11％，37．84％，4．05％，无效组为61．64％，35．62％，2．74％，经精确概率法卡方检验，无统计学差异，P>0．05。二组的等位基因频率分别为77．03％，22．97％及79．45％，20．55％，经Pearson卡方检验，P>0．05。2．3 TaqI位点分型，在有效组中，各基因型“C”型、“C／T”型及“T”型的频率分别为51．35％，31．08％，17．57％，等位基因的频率分别为66．89％，33．11％；而无效组各基因型频率依次为17．81％，52．05％，30．14％，等位基因频率为43．84％，56．16％；二组经Pearson卡方检验，显示统计学上的非常显著性差异，P<0．01。结论1、对于多潘立酮治疗功能性消化不良患者疗效的判定，相关临床症状积分结合实时B型超声胃窦运动指数的测量为一简便、安全、经济、有效的手段。2、在功能性消化不良患者中，如应用多潘立酮治疗，其疗效可能与患者多巴胺受体基因DRD2 TaqI的多态性相关，而与DRD2-141CIns／Del和A-241G基因多态性相关的依据不足。

论文目录

• 一、中文摘要
• 二、英文摘要
• 三、正文
• 前言
• 第一部分 多潘立酮治疗功能性消化不良患者有效组及无效组的确立
• 1.技术路线
• 2.临床资料与方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 5.结论
• 6.参考文献
• 2受体基因141C Ins/Del、A-241G、TaqI多态性与多潘立酮疗效关系的研究'>第二部分 FD患者多巴胺D₂受体基因141C Ins/Del、A-241G、TaqI多态性与多潘立酮疗效关系的研究
• 1.技术路线
• 2.材料与方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 5.结论
• 6.参考文献
• 四、综述
• 综述一
• 综述二
• 五、致谢