葡萄茎尖的超低温保存及其再生植株的遗传稳定性研究

论文摘要

植物遗传资源是人类赖以生存和发展的最重要的物质基础,保持其遗传多样性是人类实现可持续发展的重要保证。超低温保存安全可靠、占用空间小、节省开支,正在成为田间保存的重要补充技术。本试验采用玻璃化法超低温保存葡萄（Vitis L.）试管苗茎尖,并对保存后再生植株进行了遗传稳定性分析。主要研究结果如下:1初步建立玻璃化超低温保存葡萄茎尖的体系选取5mm左右的葡萄试管苗茎尖在含0.3%的蔗醣培养基上预培养48h,切取3 mm左右长的茎尖,在25℃下用60%玻璃化溶液2（PVS2）处理40min,再用PVS2于O℃下处理70min,换新鲜的PVS2溶液,迅速投入到液氮中保存,24h后取出,在38℃水浴中迅速解冻90s,再用1.2mol/L蔗糖培养基洗涤2次,每次10min,接种于含MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1 mg/L的MS培养基上,25℃弱光培养7d后转入正常光下培养,其成活率和再生率分别为50.0%和13.3%。2获得适合葡萄的SRAP-PCR体系和程序所用的反应程序是:94℃4min,1个循环;94℃1min,35℃1min,72℃2min,5个循环;94℃1min,55.5℃1min,72℃2min,30个循环;72℃延伸5min。试验中对体系的模板DNA、Taq酶、引物、MgCl2、dNTPs等五个关键因子进行了单因子试验,得到适合SRAP-PCR的反应体系:模板DNA4.0μL、Taq酶1.0μL、引物对9.0μL×2、MgCl23.0μL、dNTPs1.0μL、10×buffer4.0μL、ddH2O9.0μL,总体积是40μL。3利用SRAP标记技术对超低温保存后再生植株的遗传稳定性进行检测,结果表明:利用试验中优化的超低温保存体系进行葡萄（Vitis）茎尖的超低温保存,其再生植株能够保持材料的原有性状和遗传特征。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 问题提出
• 2 研究进展
• 2.1 植物种质资源保存技术研究进展
• 2.1.1 一般保存
• 2.1.2 缓慢生长法离体保存
• 2.1.3 超低温保存（Cryopreservation）
• 2.2 植物种质资源离体保存过程中的遗传变异研究
• 2.2.1 体细胞无性系产生的原因及其影响因素
• 2.2.2 体细胞无性系变异的检测
• 2.2.3 超低温保存过程中的遗传变异
• 3 SRAP标记技术
• 3.1 SRAP标记的原理
• 3.2 SRAP标记的技术流程
• 3.2.1 SRAP-PCR扩增
• 3.2.2 产物的凝胶电泳分析
• 3.3 SRAP标记的应用
• 3.3.1 遗传多样性分析
• 3.3.2 遗传图谱的构建
• 3.3.3 比较基因组学
• 3.3.4 重要性状的标记
• 4 本研究的目的和内容
• 第二章 玻璃化法超低温保存葡萄茎尖体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验仪器和试剂
• 1.2.1 试验仪器
• 1.2.2 试验试剂
• 1.3 试验设计
• 1.4 试验基本过程
• 1.5 试验方法
• 1.5.1 材料的组织培养
• 1.5.2 茎尖的预培养
• 1.5.3 预处理
• 1.5.4 玻璃化溶液的筛选、处理和冰冻保存
• 1.5.5 解冻与洗涤
• 1.5.6 恢复培养
• 2 结果与分析
• 2.1 蔗糖预培养
• 2.2 预处理
• 2处理'>2.3 PVS₂处理
• 2.4 不同玻璃化保护剂对茎尖成活率和再生率的影响
• 2.5 恢复培养基对茎尖成活率和再生率的影响
• 3 讨论
• 3.1 预培养对保存后茎尖成活率和再生率的影响
• 3.2 冰冻保护剂
• 3.3 解冻和洗涤方式对保存后茎尖成活率和再生率的影响
• 3.4 恢复培养条件对保存后茎尖成活率和再生率的影响
• 3.5 材料培养再生及其形态发生
• 4 小结
• 第三章 再生植株遗传稳定性的分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验仪器和试剂
• 1.2.1 试验仪器
• 1.2.2 试验试剂
• 1.3 试验方法
• 1.3.1 CTAB法提取幼苗基因组DNA
• 1.3.2 基因组DNA质量的检测
• 1.3.2.1 DNA浓度和质量检测
• 1.3.2.2 电泳检测 DNA的完整性
• 1.3.3 SRAP-PCR反应体系的优化
• 1.3.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法
• 1.3.5 引物的筛选
• 1.3.6 数据的处理
• 2 结果与分析
• 2.1 CTAB法提取幼苗基因组DNA的质量
• 2.1.1 基因组 DNA质量的检测
• 2.1.2 基因组 DNA完整性的检测
• 2.2 SRAP-PCR反应体系的优化
• 2+浓度对SRAP反应的影响'>2.2.1 Mg²⁺浓度对SRAP反应的影响
• 2.2.2 dNTPs浓度对SRAP反应的影响
• 2.2.3 Taq酶浓度对SRAP反应的影响
• 2.2.4 引物浓度对SRAP反应的影响
• 2.2.5 模板DNA浓度对SRAP反应的影响
• 2.3 引物筛选
• 2.4 再生植株遗传稳定性的分析
• 3 讨论
• 3.1 基因组 DNA的质量
• 3.2 SRAP-PCR反应体系
• 3.3 再生植株的遗传稳定性
• 4 小结
• 4.1 获得了适合葡萄的SRAP反应体系和程序
• 4.2 初步对超低温保存后再生植株的遗传稳定性进行了研究
• 结论
• 创新点
• 参考文献
• 附录 Ⅰ
• 附录 Ⅱ
• 附录 Ⅲ
• 致谢
• 作者简介