BM-MSCs移植治疗AMI大鼠模型的疗效及其机制的研究

2020-12-11阅读(796)

论文摘要

目的：观察间充质干细胞（MSCs）移植治疗大鼠急性心肌梗死（AMI）的可行性,评价普通MSCs和经生长因子预处理的MSCs （GF-MSCs）移植对AMI大鼠模型心脏形态结构及功能的影响,并探讨其治疗作用的机制。方法：1、建立大鼠心肌梗死模型：30只雌性SD大鼠随机分成AMI组和Sham组,AMI组大鼠结扎前降支,建立AMI模型；Sham组为假手术组。术后4周行超声心动和血流动力学检查,处死后留心脏标本作病理学检查。而后,应用该方法再次制作AMI雌性大鼠模型39只备用。2、大鼠BM-MSCs的分离、培养和扩增及GF-MSCs的培养和扩增：MSCs分离、培养扩增后,应用流式细胞仪检测MSCs表型；GF-MSCs培养扩增后,免疫荧光染色和RT-PCR检测TnI和Des的表达；检测MSCs和GF-MSCs的细胞周期；应用ELISA检测HGF和VEGF在MSCs和GF-MSCs细胞裂解液及培养上清中的蛋白浓度。3、MSCs和GF-MSCs移植治疗AMI大鼠模型：将AMI大鼠模型39只随机分成MSCs组、GF-MSCs组和NS组,每组13只,分别心肌内注射CM-Dil标记的MSCs、GF-MSCs或生理盐水,细胞移植4周后观察：（1）各组大鼠一般情况；（2）超声心动指标；（3）血流动力学指标；（4）形态学与病理学改变。4、细胞移植治疗作用机制：（1）RT-PCR检测心肌组织Y染色体；（2）免疫荧光染色检测心肌组织TnI和Des的表达；（3）RT-PCR检测心肌组织MMP2、MMP9、TIMP1、SDF1-α、Tn1和Des mRNA的表达水平；（4）ELISA检测心肌组织TNF-αVEGF和HGF蛋白含量；（5） TUNEL凋亡分析；Western Blot检测Caspase 3表达水平；（6）检测心肌氧化应激水平。结果：1、结扎大鼠前降支建立AMI模型：（1）与Sham组相比,AMI组大鼠的LVEDD和LVESD增大,LVEF和FS减低（P<0.01）；]LVSP、+dP/dtmax、-dP/dtmax降低,LVEDP升高（P<0.01）。（2）HE染色显示AMI组大鼠心肌纤维排列紊乱、断裂或肥大,部分心肌细胞丢失、呈空泡变性,间质水肿,心肌纤维间散在淋巴细胞浸润；Sham组大鼠心肌组织大致正常。Masson染色显示AMI组大鼠心肌胶原纤维明显增多,Sham组大致正常。2、体外MSCs及GF-MSCs的培养扩增：（1）MSCs呈梭形、贴壁生长,并表达CD105、CD44、CD29,而不表达CD31和CD34、D45;体外培养的GF-MSCs贴壁生长,细胞呈梭形或多角形,形态与诱导前的MSCs相似,免疫荧光染色和RT-PCR结果显示TnI和Des表达阳性。（2）细胞周期分析发现MSCs G1期细胞的比例高于GF-MSCs （P＜0.05）,而G2期和S期细胞的比例低于GF-MSCs （P<0.05）。（3） HGF和VEGF在细胞裂解液以及细胞培养上清中的蛋白浓度,GF-MSCs高于MSCs （P＜0.01）。3、细胞移植疗效：（1）细胞移植4周后,各治疗组均无大鼠死亡。MSCs组和GF-MSCs组大鼠的一般状况较NS组好。NS组心脏重量/体质量比值高于MSCs组和GF-MSCs组（P<0.05）。（2）与NS组相比,MSCs组和GF-MSCs组大鼠的LVEDD和LVESD减小,LVEF和FS升高（P<0.01）；与MSCs组比较,GF-MSCs组的LVEDD和LVESD减小,LVEF和FS升高（P<0.05）（3）与NS组相比,MSCs组和GF-MSCs组大鼠的LVSP、+dP/dtmax、-dP/dtmax升高,LVEDP降低（P<0.01）；与MSCs组比较,GF-MSCs组的LVSP、+dP/dtmaX、-dP/dtmax升高,LVEDP降低（P<0.05）。（4）HE染色显示,NS组大鼠心肌纤维排列紊乱、肥大,间质水肿、淋巴细胞浸润明显；MSCs组和GF-MSCs组大鼠心肌间质淋巴细胞浸润较少。（5）Masson染色显示,NS组大鼠心肌胶原纤维明显多于MSCs组和GF-MSCs组；大鼠心肌纤维化面积比率定量分析,NS组高于MSCs组（36.27±1.65%vs 17.32±1.08%,P<0.01）和GF-MSCs组（36.27±1.65%vs 7.26±0.42,P<0.01）,GF-MSCs组低于MSCs组（7.26±0.42% vs 17.32±1.08%,P<0.01）。4、细胞治疗作用机制：（1）Y染色体mRNA在雌性AMI大鼠模型MSCs组和GF-MSCs组的心肌组织内均有表达。（2）CM-Dil标记细胞在MSCs组和GF-MSCs组大鼠的心肌组织中TnI和Des免疫荧光染色均阳性；心肌组织中TnI和Des mRNA表达水平,MSCs组和GF-MSCs组高于NS组（P<0.01）,GF-MSCs组高于MSCs组（P<0.01）。（3）心肌组织中TNF-a的蛋白含量,NS组高于MSCs组和GF-MSCs组（P<0.01）,GF-MSCs组低于MSCs组（P<0.01）。（4）心肌组织MMP2 mRNA表达水平,NS组低于MSCs组和GF-MSCs组（P>0.05）；MMP9和TIMP1 mRNA表达水平,NS组高于MSCs组和GF-MSCs组（P<0.01）,GF-MSCs组低于MSCs组（P<0.01）。（5）心肌组织SDF1-α的mRNA表达水平,NS组低于MSCs组和GF-MSCs组（P<0.01）,GF-MSCs组高于MSCs组（P<0.01）；心肌组织中VEGF和HGF蛋白含量,NS组低于MSCs组和GF-MSCs组（P<0.01）,GF-MSCs组高于MSCs组（P<0.01）。（6）心肌细胞凋亡指数,NS组高于MSCs组和GF-MSCs组（P<0.01）,GF-MSCs组低于MSCs组（P<0.01）;Western Blot检测心肌组织中Caspase-3蛋白表达水平,NS组高于MSCs组和GF-MSCs组, GF-MSCs组低于MSCs组（P<0.01）。（7）心肌组织总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力,NS组低于MSCs组和GF-MSCs组（P<0.01）,GF-MSCs组高于MSCs组（P<0.01）。丙二醛（MDA）含量,NS组高于MSCs组和GF-MSCs组（P<0.01）, GF-MSCs组低于MSCs组（P<0.01）。结论：1、结扎大鼠冠状动脉左前降支可成功建立急性心肌梗死（AMI）大鼠模型。2、体外3种生长因子（BMP-2、FGF-2和IGF-1）预处理能诱导大鼠骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）向心肌样细胞分化,并增强其旁分泌能力。3、直接心肌内注射MSCs能在一定程度上改善心肌梗死大鼠的心脏结构和心功能,可能与MSCs发挥旁分泌作用,减轻AMI大鼠心肌组织炎症反应、减少心肌纤维化、降低心肌细胞凋亡、减轻心肌氧化应激反应有关。4、经生长因子预处理的大鼠BM-MSCs （GF-MSCs）治疗效果优于普通MSCs,其作用机制可能为：生长因子预处理可促进MSCs（?）心肌样细胞分化,增强其旁分泌效应,增加心肌功能蛋白mRNA表达,使得GF-MSCs抑制心肌炎症反应、减少心肌纤维化、抗细胞凋亡和减轻心肌氧化应激反应的作用强于普通MSCs。

论文目录

中文摘要

Abstract

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、大鼠心肌梗死模型的建立

1.1 材料与方法

1.1.1 实验动物

1.1.2 实验试剂及器械设备

1.1.3 心肌梗死大鼠模型的建立

1.1.4 心肌梗死大鼠模型的检测

1.1.5 统计学方法

1.2 结果

1.2.1 死亡率及一般情况

1.2.2 超声心动检测结果

1.2.3 血流动力学检测结果

1.2.4 形态学和病理学改变

1.3 讨论

1.3.1 麻醉

1.3.2 呼吸控制及肺的保护

1.3.3 冠状动脉前降支的定位和结扎

1.4 小结

二、MSCs的培养扩增和诱导分化

2.1 材料与方法

2.1.1 实验动物

2.1.2 主要仪器及试剂

2.1.3 主要溶液的配制

2.1.4 大鼠骨髓来源的MSCs分离培养和诱导分化

2.1.5 流式细胞仪检测细胞表型和细胞周期

2.1.6 免疫荧光染色

2.1.7 逆转录酶-聚合酶链式反应

2.1.8 细胞因子在细胞裂解液以及细胞培养上清蛋白表达

2.1.9 统计学方法

2.2 结果

2.2.1 MSCs形态

2.2.2 流式细胞仪鉴定细胞表型结果

2.2.3 生长因子诱导MSC向心肌细胞分化

2.2.4 GF-MSCs免疫荧光检测结果

2.2.5 RT-PCR检测细胞TNI和Des mRNA的表达结果

2.2.6 细胞周期测定结果

2.2.7 细胞因子检测结果

2.3 讨论

2.3.1 骨髓来源MSCs的提取

2.3.2 MSCs的鉴定

2.3.3 体外诱导MSCs向心肌样细胞分化

2.3.4 生长因子预处理对MSCs细胞周期的影响

2.3.5 生长因子预处理增强MSCs的旁分泌功能

2.4 小结

三、细胞移植治疗心肌梗死大鼠模型的疗效

3.1 材料与方法

3.1.1 实验动物

3.1.2 主要仪器与主要试剂

3.1.3 细胞移植治疗AMI大鼠模型

3.1.4 细胞移植后疗效评价

3.1.5 统计学方法

3.2 结果

3.2.1 CM-Dil标记的MSC

3.2.2 各组大鼠一般情况

3.2.3 超声心动图检测结果

3.2.4 血流动力学检测结果

3.2.5 形态学和病理学改变

3.3 讨论

3.3.1 细胞移植时机和移植途径

3.3.2 移植MSCs对心脏结构和功能的影响

3.3.3 移植MSCs存活及分化

3.3.4 移植MSCs对心肌组织炎症反应的影响

3.3.5 移植MSCs对心肌纤维化的影响

3.4 小结

四、细胞治疗作用机制

4.1 材料与方法

4.1.1 实验仪器与试剂

4.1.2 免疫荧光染色

4.1.3 心肌细胞凋亡的原位检测

4.1.4 半定量逆转录酶聚合酶链式反应

4.1.5 心肌组织TNF-α、VEGF和HGF含量检测

4.1.6 免疫蛋白印迹分析

4.1.7 心肌氧化应激水平测定

4.1.8 统计学方法

4.2 结果

4.2.1 免疫荧光检测结果

4.2.2 SQRT-PCR结果

4.2.3 ELISA结果

4.2.4 TUNEL凋亡分析结果

4.2.5 Western Blot检测结果

4.2.6 氧化应激水平检测结果

4.3 讨论

4.3.1 MSCs在心肌组织存活并分化为心肌样细胞

4.3.2 MSCs减轻心肌组织炎症反应作用机制

4.3.3 MSCs影响心肌纤维化的的作用机制

4.3.4 MSCs对心肌细胞凋亡的影响

4.3.5 MSCs对心肌组织氧化应激反应的影响

4.3.6 MSCs旁分泌效应

4.4 小结

论文局限性

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述干细胞治疗年龄相关性心脑血管病研究进展

综述参考文献

致谢

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