毛竹MLE转座子转座活性的鉴定与分析

论文摘要

转座子（TransposableElement，TEs），又称跳跃因子，是能够改变自身位置的一段DNA序列。Mariner-like转座子（简称MLE转座子）是一类在动物和植物中广泛存在的DNA转座子。本课题组在分离得到的具有完整转座酶结构的毛竹MLE转座子的基础上，1)采用酿酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）检测系统，鉴定其转座活性：将转座酶CDS序列，构建到酵母供体载体pAG413-gal上，将非自主MLE转座子，构建到酵母表达载体pWL89a上，然后将这两个重组载体共同转化酵母，经过选择性培养、诱导筛选后，对活性酵母菌液PCR检测，发现竹亚科的MLE转座子在酵母中也能转座，通过序列比对，发现其转座后并没产生转座足迹。2)采用植物拟南芥（Arabidopsisthaliana）转基因表达系统，鉴定其在植物中活性表达：将非自主MLE转座子和转座酶全长构建到拟南芥表达载体PCAMBIA1304+上，然后转化到拟南芥中，筛选和鉴定转基因植物，实现MLE转座子在拟南芥中的表达。本研究以克隆到的毛竹MLE转座子全长为基础，应用酵母系统检测转座子转座活性，为进一步构建高活性的毛竹MLE转座子和开发MLE转座子的分子标签系统奠定基础；同时，拟南芥转基因表达的研究，为研究MLE转座子在植物基因组中插入的偏好性及遗传稳定性打下基础，将为大规模构建植物突变体库和研究基因功能提供新的工具，使竹亚科基因的分离与鉴定更加简单易行，加快竹亚科基因组学的研究进程。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 转座子类型
• 1.3 MLE转座子
• 1.3.1 MLE转座子的发现
• 1.3.2 MLE转座子的结构特点
• 1.3.3 MLE转座子的转座机制
• 1.3.4 活性MLE转座子的研究
• 1.4 转座子的活性分析
• 1.5 转座子的应用
• 1.5.1 转座子标签法
• 1.5.2 培育转基因动物与基因治疗
• 1.5.3 鉴定基因组功能及生物群体多样性
• 1.6 本研究基础
• 1.7 技术路线
• 1.8 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 各种酶类和试剂盒
• 2.1.3 主要仪器与设备
• 2.1.4 实验试剂
• 2.1.5 引物设计
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 毛竹MLE转座子全长的分离
• 2.2.1.1 提取基因组DNA
• 2.2.1.2 毛竹MLE转座子的PCR扩增
• 2.2.1.3 PCR产物的克隆
• 2.2.2 毛竹MLE转座子活性检测
• 2.2.2.1 酵母载体的构建
• 2.2.2.1.1 转座酶拼接到载体pAG413-gal上
• 2.2.2.1.2 非自主转座子拼接到载体pWL89a
• 2.2.2.2 酵母转化实验（PEG/LiAc法）
• 2.2.2.3 转座活性检测
• 2.2.3 转座子转化拟南芥实验
• 2.2.3.1 拟南芥转化载体构建
• 2.2.3.2 拟南芥植株的培养
• 2.2.3.3 农杆菌转化实验
• 2.2.3.4 拟南芥转化实验
• 2.2.3.5 转基因植株的筛选和鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 毛竹MLE转座子全长的分离
• 3.1.1 毛竹基因组DNA的提取
• 3.1.2 毛竹MLE转座子全长的扩增
• 3.2 转座活性的检测
• 3.2.1 酵母转化载体的构建
• 3.2.1.1 转座酶CDS序列与载体pAG413-gal拼接
• 3.2.1.2 非自主转座子与质粒pWL89a拼接
• 3.2.2 转化酵母实验结果
• 3.2.2.1 酵母菌液PCR检测结果
• 3.2.2.2 转座足迹的检测
• 3.3 转座子在拟南芥中的表达分析
• 3.3.1 拟南芥转化载体的构建
• 3.3.1.1 中间载体pCAMBIA1304+的构建
• 3.3.1.2 非自主序列和转座酶全长的PCR扩增
• 3.3.1.3 拟南芥转化载体酶切结果
• 3.3.1.4 拟南芥重组载体检测结果
• 3.3.2 转化拟南芥实验结果
• 3.3.2.1 拟南芥植物的培养
• 3.3.2.2 农杆菌转化实验
• 3.3.2.3 转化拟南芥实验
• 3.3.2.4 转化植株的筛选和鉴定
• 小结
• 4 结论与讨论
• 5 展望
• 参考文献
• 个人简介
• 致谢
• 附图