论文摘要
细胞因子是由多种细胞分泌的一类小的、非结构性的信号传导蛋白分子,几乎所有的有核细胞都能够合成这类蛋白并且对之起反应,是免疫系统细胞间,以及免疫系统细胞与其他类型细胞间联络的核心。细胞因子通过与细胞特异的膜受体而起作用,能改变分泌细胞自身或其他细胞的行为或性质。根据细胞因子功能的不同对细胞因子有不同的分类方式,在感染及炎症反应中某些细胞因子主要促进炎症反应,称之为前炎症细胞因子或促炎症细胞因子,某些细胞因子可抑制前炎症细胞因子的活性或抑制炎症反应,称之为抗炎细胞因子,最重要的前炎症因子包括肿瘤坏死因子-α（TNF-a）和白介素-1（IL-1）。这种分类是炎症细胞因子生物学和其临床医学的基础。TNF-α主要是由活化的单核细胞/巨噬细胞/T细胞产生的一种细胞因子,早期研究发现TNF-α能诱导肿瘤细胞坏死或凋亡,后来发现TNF-α可介导特定炎症反应并能调节免疫功能。TNF-α主要是通过细胞膜上的肿瘤坏死因子受体（TNF-R1）启动了TNF-α的大多数生物活性,触发一系列的分子内事件,最终导致两个主要转录因子NF-κB和c-Jun的激活。这两个转录因子可诱导多个基因的表达,从而引起多个不同的生物进程,包括细胞生长与死亡、肿瘤形成、免疫、炎症以及应激反应。不适当的TNF-α产生以及TNF-α信号的持久激活将导致广泛的人类病理进程,包括全身炎症反应综合征、炎性肠病、风湿性关节炎、脑型疟疾、糖尿病、癌症、骨质疏松症、同种异体移植排斥、多发硬化症等。鉴于TNF-α是激发炎症进程的初始和最重要的介质之一,对于其活性的抑制是近来颇受关注的药物研究靶标,以其为靶点的药物已成功地用于多种炎性疾病的治疗,如英夫利西单抗（Infliximab）、依那西普（Etanercept）、阿达木单抗（Adalimumab）已由美国FDA批准用于类风湿性关节炎及克隆氏病的治疗,在2009年世界畅销药物排行榜中,上述三种药物均进入了十强,销售额超过了50亿美金。在我国的传统中药中,多种中药及其主要有效成分表现出了较强的抗炎作用,其作用靶点可能与抑制TNF-α相关。最近的研究表明,中药当归的乙酸乙酯提取物能够提高小鼠注射LPS后的生存率,降低小鼠体内的TNF-α含量,下调体内的NF-κB活性。另外有研究报道,当归中的主要成分藁本内酯（占当归挥发油50%以上）体外可抑制LPS诱导的单核细胞释放TNF-α,这种抑制作用可能与藁本内酯对TNF-αmRNA转录的抑制作用有关,同时基因分析表明,藁本内酯可以抑制TNF-α介导的NF-κB活性。全身炎症反应综合征（Systemic inflammatory response syndrome,SIRS）是机体对多种细胞因子和炎症介质释放所产生的全身反应,可以由感染或非感染因素诱发。其中由感染或有高度可疑感染灶引起的称之为脓毒症（Sepsis）,严重情况下可致脓毒性休克（Septic shock）。越来越多的证据表明大多数SIRS是由革兰氏阴性细菌的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）所引发的。LPS可通过刺激多个内源性炎症介质激发一系列的炎症反应从而引起内毒素休克。在LPS导致的内毒素休克中,TNF-α是最早期释放且起核心作用的炎性介质。TNF-α可促使其它炎性介质如IFN-γ、IL-6及IL-12的快速生成,造成细胞因子激联放大反应,导致所谓“瀑布效应”,使机体处于高代谢状态并激发机体一系列病理生理改变,如发热、低血压、乳酸酸中毒和不可逆性休克。IL-1β是另一种重要的前炎症因子,和TNF-α具有协同作用,同时抑制TNF-α和IL-1β对治疗SIRS有积极的意义。鉴于藁本内酯明确的TNF-α抑制作用并结合SIRS的病理机制及临床表现,我们推测其对全身炎症反应综合征具有一定的保护作用。在药效学的实验设计中我们以TNF-α为靶点,通过一系列的体内、体外实验系统评价了藁本内酯对全身炎症反应综合征的治疗作用,并对其机制进行了初步的探讨。研究结果显示,藁本内酯可抑制LPS诱导的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7）释放TNF-α, IC50值为16.3μM。在体内药效学研究中,基于LPS与SIRS发生发展的密切关系,我们建立了以LPS诱导的小鼠内毒素休克和兔内毒素休克两种主要药效学动物模型,并在这两种模型上评价藁本内酯对SIRS的治疗作用。静脉注射40mg/kg LPS可成功诱导出小鼠内毒素休克模型,与模型组比较,藁本内酯能提高内毒素休克小鼠的生存率,延长平均生存时间并呈剂量依赖性,表明藁本内酯对内毒素致小鼠休克性死亡有明显的保护作用；在兔内素素休克实验中,静脉注射300μg/kg LPS后可成功诱导出兔休克模型。在整个实验过程中测量平均动脉压（MAP）、心率（HR）、肛温（RT）,并在注射LPS后的不同时间点采取血样,测定血清中TNF-α、IL-1β及NO含量、各项血液生化指标（ALT、AST、ALP、GGT、CK、LDH、TP、Scr、BUN、T. BIL）、血液有形成分及血液流变学指标,实验结束时留取心、肝、肺及肾等重要器官作组织病理学检查。实验结果显示,兔给予LPS后,模型组动物所测各时间点MAP均明显下降,肛温持续下降,出现较严重的休克症状（临床统计数据显示：死于感染性休克的患者中约有50%是由于低血压所致）。与模型组比较,藁本内酯各剂量组（80mg/kg、40mg/kg、20mg/kg）均可明显抑制MAP、RT的下降,显著降低血液中TNF-αIL-1β和NO含量,多项血液生化指标ALT、AST、ALP、GGT, LDH、CK、BUN和Scr的含量也明显减少,主要脏器病理损伤可见明显改善。上述实验结果表明藁本内酯对内毒素休克兔有明显的保护作用。次要药效学模型中我们选用了二甲苯致小鼠耳肿胀和角叉菜胶性足肿胀两个多种炎症介质参与反应的急性炎症模型,研究结果表明,与模型对照组比较,藁本内酯对二甲苯致小鼠耳肿胀和角叉菜胶所致大鼠足肿均有明显的呈剂量依赖性的抑制作用,表明藁本内酯具有明确的抗炎作用,此研究结果为藁本内酯抗休克治疗提供了佐证。综合上述实验结果,藁本内酯具有明显的抗内毒素休克、抗炎作用,其作用可能与藁本内酯抑制多种炎症介质TNF-α、IL-1β和NO的释放密切相关,表明藁本内酯可作为治疗全身炎症反应综合征的候选药物进行进一步的研究和评价。苦木是另一种传统抗炎中药,我国民间多用于清热燥湿、抗菌消炎、治疗菌痢、胃肠炎、胆道感染、急性化脓性感染等疾患。苦木的现代临床应用主要以胃肠道相关疾病为主,如以苦木为主要成分的成方制剂苦木消炎片、莲胆消炎片等临床上多用于细菌性痢疾,急性胃肠炎的治疗。对苦木的化学成分研究表明,苦木的主要化学成分为一组吲哚类生物碱,近年来文献报道苦木中多种生物碱可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞分泌TNF-α、NO和IL-6,并对消化道溃疡有良好的治疗效果。炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD）是一组病因未明的累及胃肠道的慢性炎症性疾病,主要包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）和克隆氏病克隆氏病（Crohn’S disease, CD）.该病治愈难度大,易复发,治疗上缺乏特异有效的药物,世界卫生组织将其列为现代难治病之一。TNF-a作为一种重要的促炎症因子和免疫调节因子,与IBD发病及病情的发展有着密切的关系。4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮是苦木中含量最高的主要生物碱成分,基于已有研究基础,我们推测4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮对溃疡性结肠炎有一定的治疗潜力。在药效学的实验设计中我们通过一系列的体内、体外实验系统评价了4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮的抗炎作用及对于溃疡性结肠炎的治疗作用,并对其抗炎作用机制进行了研究。在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的大鼠溃疡性结肠炎模型中,口服4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮（40mg/kg、20mg/kg）可以显著抑制大鼠体重的下降,改善溃疡的严重程度,减轻结肠萎缩症状,降低结肠组织中的髓过氧化物酶（MPO）活性、抑制血清中的TNF-α水平,病理切片可见4-甲氧基-5羟基铁屎米酮对结肠组织的损伤进程有明显的保护作用。结果表明4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮对DSS诱导的大鼠溃疡性结肠炎具有明显的的治疗作用。此外,在急性炎症模型实验中,与模型对照组比较,4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮对二甲苯致小鼠耳肿胀和角叉菜胶所致大鼠足肿胀均有不同程度的抑制作用。综合上述实验结果,4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮具有较强的抗炎活性,并对DSS诱导的溃疡性结肠炎有明确的治疗作用。在4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮抗炎作用机制研究中,我们的实验结果证明该化合物在体内、外实验中均表现出对促炎症细胞因子TNF-α的抑制作用。此外,已有文献报道,日本学者于20世纪80年代研究发现苦木生物碱对磷酸二酯酶（PDE）有一定的抑制作用,而在磷酸二酯酶大家族中（PDE 1-11）,PDE4在炎症和免疫调节细胞中起重要作用并被认为与炎性肠病密切相关,对PDE4的抑制作用可阻止单核细胞释放TNF-α,至今未见到关于苦木生物碱对PDE4活性作用的相关报道。为进一步确证该化合物抗炎作用靶点,我们采用HPLC方法测定了4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮体外对PDE4的抑制活性,实验结果显示,4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮对PDE4具有较强的抑制作用。综合上述实验结果,4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮的抗炎作用机制与其对TNF-α的抑制作用密切相关,而该化合物对PDE4的抑制活性可能是其TNF-α抑制作用的靶点之一。总之,随着近年来对炎症疾病发生和发展机制的进一步研究,TNF-α作为炎症进程最重要的介质之一,对其活性的抑制已逐渐成为国际上引人注目的药物研究靶标,并已有以其为靶点的药物已成功地用于多种炎性疾病的治疗。因此,在我们的研究课题中以TNF-α为靶标,评价了中国两个传统中药当归及苦木中的主要抗炎成分藁本内酯和4-甲氧基-5羟基铁屎米酮体内、外对TNF-α的抑制作用,结合两种中药的临床应用及研究进展,分别评价了藁本内酯对全身炎症反应综合征及4-甲氧基-5羟基铁屎米酮对溃疡性结肠炎的治疗作用,两者均表现出了良好的治疗潜力,提示我们该两种成分值得作为候选药物进行进一步的研究与评价,本研究结果也将为该两种单体成分的新药临床前研究提供理论基础及数据支持。
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