戊型肝炎病毒感染机制初步研究

论文摘要

戊型肝炎病毒（HEV）不稳定易降解,难以从载毒标本中分离,而迄今为止仍没有有效的细胞培养模型,这很大程度上限制了HEV感染致病机制的研究。近年来,随着对HEV研究的深入,较好模拟了HEV病毒衣壳表面结构的重组蛋白为研究HEV与宿主细胞相互作用提供了一条新的途径。HEV衣壳由单一蛋白（pORF2）组成,大量研究表明pORF2的重组表达片段p239（aa368—606）很好地模拟了HEV的免疫优势中和表位。p239对HEV与原代肝细胞、HepG2细胞的吸附阻断,p239对多株细胞系具有与HEV相似的嗜性,以及多株HEV特异单抗对p239与HepG2细胞结合的特异阻断,强有力地提示p239同时也很好地模拟了HEV与细胞膜的结合所具备的表面结构特征。因此,p239与HepG2细胞的吸附模型是探讨HEV与细胞膜相瓦作用的可靠工具。不同结合区域的HEV单抗及其Fab片段对p239吸附细胞的阻断结果提示,p239表面至少存在两个细胞受体结合区域:其一为HEV的主要免疫优势中和表位（ORF2 aa459-606）,另一个区域为aa423-438。这两个区域均对p239与细胞的特异性吸附有贡献,均能单独介导p239与嗜性细胞的吸附,但aa459-606区域吸附细胞的能力要明显强于后者,是介导p239吸附的主要部位。aa423-438区域与细胞表面作用力弱,在HEV结合过程中很可能只是增加病毒与主要受体结合的机会。缺失了aa423-438的p239突变体Δ239保留了免疫优势中和表位,与p239一样均能阻断天然HEV对HepG2细胞的感染吸附。而丧失免疫优势表位的233N则不能有效阻断。此结果表明HEV与嗜性细胞的结合很可能同p239与HepG2细胞之间的结合一样,也是通过这两个区域,并且主要免疫优势区域（ORF2aa459-606）在HEV与细胞结合过程中发挥主要作用。通过酵母双杂交,从人肝细胞cDNA文库中筛出四个可能与HEV衣壳蛋白相结合的蛋白:肝细胞药物代谢酶（p450）、转化相关蛋白（TRP13）、p38相结合蛋白（p38IP）、DDAH2。并通过免疫共沉淀初步验证了p38IP与E2的结合,提示HEV ORF2激活MAPK p38通路的可能。通过亲和层析筛选HepG2、猴肝组织中与p239相结合的蛋白,并利用二维电泳（2-DE）结合生物质谱技术分离鉴定这些结合蛋白,得到6个可能与p239相互作用的蛋白:HSP90、GRP78/Bip、alpha tubulin、P43、ATPase beta subunit、某未命名蛋白。并通过免疫共沉淀、细胞共定位等多种实验手段进一步验证了GRP78/Bip、HSP90与p239的结合。结果表明,GRP78/Bip与p239、HSP90与p239在HepG2细胞内共定位。并且p239与E.coli表达经纯化的GRP78/Bip可直接结合,提示它们在细胞内的相互作用不是经由第三者为中介的结合。同时,ATP的加入会导致p239与GRP78/Bip结合的可逆解离,提示p239与GRP78/Bip的结合是ATP依赖的特异性结合,GRP78/Bip的ATPase活性在这种结合中有重要的作用。本文建立了能较好模拟HEV与细胞的吸附过程的p239-HepG2吸附模型,进一步发现HEV上至少具有两个细胞受体结合区域。其中一个结合力较强的区域与HEV主要中和表位区域重叠,而另一个区域结合力较弱。为阐明HEV吸附机制奠定了良好基础,并提供了重要的研究工具。而对细胞内的p239结合蛋白的分离鉴定则为阐明HEV的复制、致病机制提供了重要线索。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要（Abstract）
• 缩略词
• 前言
• 1.病毒入侵过程中与宿主细胞之间的相互作用网络
• 1.1.病毒穿膜
• 1.2.病毒基因的靶向转运
• 1.3.病毒诱导的信号传导
• 2.用于研究病毒与宿主蛋白相互作用的方法
• 2.1.生物物理学方法
• 2.2.分子生物学方法
• 2.3.生物信息学方法
• 3.戊型肝炎病毒
• 3.1.戊型肝炎病毒的流行
• 3.2.HEV的生物学特征
• 3.3.HEV的细胞培养模型研究进展
• 3.4.HEV衣壳蛋白ORF2上中和表位的研究进展
• 4.本论文研究的目的与意义
• 材料与方法
• 1.材料
• 1.1.主要仪器
• 1.2.主要试剂与材料
• 1.3.试剂
• 1.4.培养基及常用溶液配制
• 2.方法
• 2.1.基因克隆
• 2.2.重组蛋白的表达与纯化
• 2.3.蛋白质的透析复性
• 2.4.重组蛋白的性质分析方法
• 2.5.常规细胞生物学实验方法
• 2.6.蛋白与细胞的吸附检测法
• 2.7.酵母双杂交实验方法
• 2.8.亲合层析操作方法
• 2.9.二维电泳操作步骤
• 2.10.基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）
• 2.11.HepG2细胞中蛋白基因的调取
• 2.12.免疫共沉淀
• 2.13.计算机辅助设计与分析
• 第一部分 戊型肝炎病毒细胞吸附模型的建立及病毒吸附区域初步研究
• 结果与分析
• 1.戊型肝炎病毒细胞吸附模型的建立
• 1.1.p239阻断HEV对嗜性细胞的感染
• 1.2.p239对多株细胞系的特异性吸附
• 1.3.p239对HepG2细胞吸附的特异性
• 2.病毒与受体结合区域的初步确定
• 2.1.单抗表位的空间位置关系
• 2.2.多株单抗对p239吸附HepG2细胞的阻断
• 2.3.单抗的Fab段对p239吸附HepG2细胞的阻断
• 2.4.线性单抗决定族的定位
• 2.5.E2重组蛋白多肽对HepG2细胞的吸附
• 2.6.p239蛋白结合位点缺失突变体的构建与鉴定
• 2.7.p239及其结合位点突变体△239、233N与HepG2细胞的吸附性
• 2.8.p239及其结合位点突变体△239、233N对HEV吸附HepG2细胞的影响
• 讨论
• 1.p239颗粒-HepG2细胞吸附模型
• 1.1.p239具有HEV免疫优势表位
• 1.2.p239具有HEV与嗜性细胞结合的关键表位
• 2.HEV与宿主细胞的相互作用区域
• 3.HEV细胞吸附模型的推测
• 第二部分 HEV嗜性组织中与HEV衣壳蛋白相互作用蛋白的初步研究
• 结果与分析
• 1.酵母双杂交筛选人肝细胞cDNA文库中与HEV衣壳蛋白相互作用蛋白
• 1.1.构建表达载体BD-E2和AD-E2及酵母表达BD-E2和AD-E2的活性鉴定
• 1.2.E2的表达对酵母细胞影响的检测
• 1.3.E2相互作用蛋白的筛选
• 1.4.生物信息学分析
• 1.5.阳性克隆的体外验证
• 2.HepG2细胞中与戊型肝炎病毒衣壳蛋白相互作用蛋白的初步研究
• 2.1.诱饵蛋白p239-CBP表达后中和表位及颗粒性的鉴定
• 2.2.HepG2细胞中与p239-CBP相互作用蛋白的获取
• 2.3.猴肝组织中与p239-CBP相互作用蛋白的获取
• 2.4.目的蛋白的MALDI-TOF-MS分析
• 2.5.生物信息学分析
• 3.GRP78/Bip与p239相互作用的进一步验证
• 3.1.GRP78/Bip基因的获得及GRP78/Bip的真核表达
• 3.2.HEV类病毒颗粒p239与GRP78/Bip体外免疫共沉淀
• 3.3.p239与重组Grp78/Bip可直接相互作用
• 3.4.GRP78/Bip与p239在细胞内的共定位
• 4.HSP90与p239相互作用的验证
• 4.1.免疫共沉淀验证HSP90与p239的相互作用
• 4.2.HSP90与p239的细胞共定位
• 讨论
• 1.酵母双杂交方法筛选相互作用蛋白
• 1.1.酵母双杂交系统中诱饵蛋白的选择
• 1.2.控制酵母双杂交系统高效性,稳定性的一些关键因素
• 1.3.对酵母双杂交系统中的阳性与假阳性的认识
• 2.亲和层析筛选结合蛋白
• 3.2-DE和MALDI-TOF MS分离鉴定蛋白
• 4.蛋白相互作用的进一步验证
• 5.肝炎病毒与有丝分裂原激活的蛋白激酶信号传导途径（MAPK）
• 6.热休克蛋白
• 6.1.热休克蛋白70（HSP70）
• 6.2.热休克蛋白90（HSP90）
• 论文小结与展望
• 参考文献
• 致谢