论文摘要
禽流感是由正粘病毒科A型流感病毒属禽流感病毒引起的一种严重的人畜共患病,至2008年6月19日,共有385人感染,其中243人死亡,造成了巨大的经济损失和社会公共卫生安全问题。近几年快速发展的禽流感病毒的反向遗传学操作技术为研究禽流感病毒搭建了一个重要的研究平台。我们通过扩增Hela细胞中的人RNA聚合酶Ⅰ的启动子序列、人工合成RNA聚合酶Ⅰ的终止子序列,将启动子和终止子序列连接后插入真核表达质粒pVAX1中,构建了双向转录载体pZL2006。构建的pZL2006含有两套启动子和终止子序列,即RNA聚合酶Ⅱ的启动子（CMV启动子）和终止序列（aⅡBGH）, RNA聚合酶Ⅰ的启动子（PⅠh）和鼠polⅠ终止序列（tⅠ）,通过把编码vRNA的cDNA正向克隆至polⅡ启动子和终止序列之间即可实现vRNA的转录和病毒蛋白的双表达。选用2004年越南分离A/Viet Nam/1194/2004（H5N1）禽流感H5N1毒株,扩增了其基因组全部序列共8个基因片段,经过序列测定后确认扩增的基因片段与Genbank上的序列相符,将8个基因片段分别插入pZL2006载体后利用酶切鉴定筛选出阳性克隆测序后证实全部基因片段已经正确插入载体中,8个含禽流感全部基因片段的重组质粒构成禽流感病毒的反向遗传学操作系统。利用脂质体2000将8质粒系统转染进293T/MDCK细胞中,发现转染上述8质粒的细胞在36h后出现大部分细胞变圆、死亡、小块脱落并以丝相连等特征性病变,而对照组的的细胞则完全正常；利用电境在转染8质粒的细胞上清中观察到了呈球形,直径大小约80～120nm,囊膜表面具纤突,具有流感病毒典型形态的病毒粒子；血凝实验的结果表明拯救病毒的滴度为在26～27之间,病毒具有血凝活性及滴度较高；拯救的病毒重新接种MDCK细胞后在36小时可观察到细胞变圆、死亡、小块脱落并以丝相连等与野生型毒株相似的致MDCK特征病变的特性；拯救的病毒上清接种鸡胚48小时后,接种的10枚鸡胚全部死亡,而对照的鸡胚全部存活,证明重组病毒与野生型的病毒对鸡胚均具有致死作用；PCR扩增和序列测定证实拯救病毒与禽流感病毒A/Viet Nam/1194/2004（H5N1）株相同位置的序列相同,通过以上的实验结果表明成功的构建了禽流感病毒的反向遗传学操作体系。汉坦病毒属布尼亚病毒科汉坦病毒属,是在欧亚大陆引起人类的HFRS,在美洲引起HPS的病原体,我国是受HFRS危害最为严重的国家,每年报道的病例数占世界报道病例数的90%以上。汉坦病毒株H8205株是本实验室自我国东北一HFRS病人血清中用Vero-E6细胞直接分离的毒株,同国内大部分省市的HFRS病人血清都可发生很强的免疫学反应,采用该株的NP做抗原,能较好地诊断流行于中国的汉坦病毒,已经对其生物学特性和动物致病试验等进行相关的研究,并取得了一系列的成果,但完整的基因组全序还未测定。我们通过获取含完整5’末端和3’末端的汉坦病毒H8205株L／M／S基因的全序列,与已发表的汉坦病毒的序列进行比对,发现汉坦病毒H8205株L基因与汉坦型病毒间氨基酸同源率高达95.5%～98.3%,核苷酸同源性为81.9%～88.8%；M基因与同型的代表毒株氨基酸的同源性为85.2%～99.7%,核苷酸同源性为74.5%～99.3%；S基因与同型的代表毒株氨基酸的同源性为97.2%～99.8%,核苷酸同源性为83.5%～99.4%。通过系统进化发生树发现H8205株L／M／S片段与同为汉坦型的病毒遗传距离较近,而与DOBV、SEOV、SNV、PUUV等遗传距离较远,通过参照毒株登陆国家和地区找出相近毒株,为下一步研究不同毒株的差别和抗原性变异提示方向。汉坦病毒为负链RNA病毒,由于RNA结构特点和不稳定性使得直接在分子水平上对RNA病毒基因组难以操作,自从成功建立了以流感病毒为代表的分节段的负链RNA病毒反向遗传学操作系统,开启了流感病毒研究的新篇章,但汉坦病毒反向遗传学操作系统的建立相对滞后,使汉坦病毒研究缺少一个重要的平台,相关的研究无法进行。我们选用汉坦病毒H8205株,利用分段扩增的方法得到基因组全部片段,利用Ⅱs型限制性内切酶的特性将各个基因片段连接成L／M基因全长的cDNA,序列测定表明获得的L／M基因片段的全长基因序列完全正确,没有发生突变和缺失。将汉坦病毒的L／S基因插入真核表达质粒pCDNA-3.1（+） /pCDNA-3.1（+）-Hygro中构建重组质粒,转染真核细胞后可表达汉坦病毒的反式作用蛋白L和NP蛋白。构建含人RNA聚合酶Ⅰ启动子和鼠RNA聚合酶Ⅰ终止子的质粒pp2006,将汉坦病毒L基因的非编码区和GFP融合基因插入RNA聚合酶Ⅰ启动子（PⅠh）及其终止子（tⅠ）之间构成转录单位,转染细胞后,由细胞提供polⅠ,从PⅠh启动融合基因的合成,融合基因包含汉坦病毒L基因的5’和3’端的非编码区及GFP编码基因。汉坦病毒反式作用蛋白与融合基因结合成RNPs,GFP蛋白的表达即可启动。利用脂质体2000将汉坦病毒亚基因组感染性克隆体系（PCDNA-L/PCDNA-S/pp2006-L-GFP）转染293T细胞后24小时,观测到转染细胞中出现明显的绿色荧光蛋白,而对照细胞则无绿色荧光蛋白表达,说明汉坦病毒亚基因组感染性克隆构建成功。建立汉坦病毒亚基因组反向遗传操作系统是构建汉坦病毒反向遗传操作系统重要的环节,可以利用汉坦病毒亚基因组反向遗传操作系统评估构建的含RNA聚合酶Ⅰ质粒转录病毒基因组RNA的效率,通过检测报告基因GFP表达量,筛选出最佳的转染条件并对构建的质粒进行优化,为最终建立汉坦病毒反向遗传学操作系统奠定基础。
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标签：禽流感论文; 反向遗传学论文; 汉坦病毒论文; 序列分析论文; 亚基因组感染性克隆论文;