利用SMART策略构建白桦（Betula platyphylla）雌雄花序消减库

论文摘要

白桦（Betula platyphylla）是一个经济价值较高的树种,目前关于白桦的研究已经取得了可喜的进展,但是关于白桦花发育基因的研究才刚刚起步。为了更多的了解白桦花期基因表达背景,获得调控白桦花发育的相关EST,本研究利用SMART（Switching Mechanism At 5’ end of RNA Transcript）策略构建了白桦花期雌雄花序正反向消减文库（SSH文库）,通过表达序列标签（EST）分析白桦花发育过程中的基因表达。主要研究结果如下。 1、SSH文库重组率为72%,PCR检测表明插入片段的平均长度为400bp左右。随机挑选重组体单克隆进行测序,正向文库获得150条EST序列,冗余度为6.7%:反向文库获得170条EST序列,冗余度为37.6%。 2、蛋白序列BLASTX的EST序列数据分析表明:正向文库140条独立EST序列的比对结果中,121条序列与已知功能的基因序列相似,9条序列与未知功能的基因序列相似,10条序列未能发现相似的序列;在反向文库106条独立EST序列中,84条序列与已知功能的基因序列相似,20条序列与未知功能的基因序列相似,2条序列未能发现相似的序列。在按期望值指标(E值<1e-10)进行功能分析的正向文库89条和反向文库65条EST序列中,根据每条EST对比推测的功能,分为11类,涉及到代谢、细胞防御、细胞生长分裂、细胞骨架构成、蛋白合成和分拣、光合成、物质运输、转录调节、能量代谢及信号传导等。其中与控制代谢和转录调控的基因相似的EST序列较多。 3、消减文库中容纳了一些控制花发育相关基因的EST,其功能涉及到调控花序形成和花分化,如MADS盒基因;调控花粉与柱头亲和性,如S-locus F-box基因;以及调控花粉管发育和种子成熟等。这些EST的获得为分析白桦花期基因表达,进一步克隆白桦花发育相关基因提供了资料,为后续基因表达和功能解析的研究工作提供了基础。 4、本文库中克隆到4条编码区全长的EST序列,其比对结果推测分别编码胚囊特异蛋白,细胞色素b5,泛素核糖体蛋白以及低温和盐胁迫诱导蛋白。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 白桦简介
• 1.1.1 白桦的分类地位与地理分布
• 1.1.2 中国白桦花发育研究进展
• 1.1.3 欧洲白桦花发育基因研究
• 1.2 花发育分子遗传学
• 1.2.1 植物花器官发育ABC模型
• 1.2.2 花发育过程中的基因及基因的表达调控
• 1.3 植物的性别分化
• 1.4 SSH技术及其在植物基因克隆上的应用
• 1.4.1 SSH技术的基本原理及主要特点
• 1.4.2 SSH技术在植物基因克隆上的应用
• 1.5 SMART策略
• 1.6 本项目研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 酶及化学试剂
• 2.1.3 接头和引物
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 SSH文库构建技术路线
• 2.2.2 白桦花序总RNA的提取
• 2.2.3 消减库构建
• 2.2.4 测序PCR模板制备
• 2.2.5 测序PCR反应
• 2.2.6 测序仪测序
• 3 结果分析
• 3.1 消减库的构建
• 3.1.1 高质量雌雄花RNA的获得
• 3.1.2 cDNA的扩增
• 3.1.3 Rsa Ⅰ酶切片段的获得
• 3.1.4 差异表达EST的获得
• 3.1.5 胶回收产物检测
• 3.1.6 SSH文库的质量分析
• 3.2 序列结果分析
• 3.2.1 EST序列的网上比对和同源序列的比较分析
• 3.2.2 基因功能分析
• 3.2.3 四条编码区全长EST序列的获得
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢