槐角异黄酮生物转化及其产物抗乳腺癌细胞活性研究

论文摘要

槐角富含糖苷型异黄酮,利用具有丰富水解酶系的食药用真菌进行槐角异黄酮生物转化有可能提升异黄酮的生物活性,但该方面研究少见报道。鉴于此,本论文从槐角生物转化菌株的筛选、槐角生物转化主要产物结构解析及生物转化工艺、转化产物——染料木素溶解度的测定及关联以及槐角发酵转化产物对乳腺癌细胞增殖及凋亡的研究等方面重点研究了槐角异黄酮食药用真菌生物转化及转化产物的抗乳腺癌活性,旨在为槐角异黄酮的生物转化及抗乳腺癌药物的发现提供理论及技术基础。获得的主要结果如下：通过平板透明圈法借助创新性的菌株布局图分析对30个属61株食药用真菌的槐角生物转化菌株进行初筛得到18株菌株；通过固体和液体筛选培养基中β-葡萄糖苷酶产酶复筛出菌株DS 1和N3,之后在槐角液体培养基中通过对β-葡萄糖苷酶活及槐角转化产物的分析,获得槐角异黄酮有效生物转化菌株一一裂褶菌DS1 （Schizophyllum commune DS1）.分别从槐角裂褶菌生物转化2d和16d的转化液中分离纯化出纯度达95%的两种,化合物,经LC-MS和NMR结构鉴定分别为染料木素和异樱黄素,染料木素和异樱黄素裂褶菌生物转化均为首次报道,其中异樱黄素的生物转化填补了国内外异樱黄素生物转化的研究空白。对槐角染料木素裂褶菌生物转化进行了研究。酶法转化研究结果显示：通过分离纯化获得了纯度较高的β-葡萄糖苷酶,其酶学性质为：分子量约为43.4kDa,在50℃以下具有较好的热稳定性,最适温度为50℃,最适pH为5-6,以pNPG为底物测得酶反应动力学参数Km=9.43 mmol/L,Vmax=3.39 mmol/（L.min）；裂褶菌粗酶液酶解槐角浸膏优化工艺为：酶用量0.3U,酶解4 h,酶解温度50℃,酶解初始pH 5.0,Ca2+浓度30 mmol/L,槐角浸膏浓度80 g/L,染料木素转化率达到（8.68±0.65）%（g/g）。槐角染料木素裂褶菌发酵转化优化工艺为：种龄3d、二级发酵、pH自然,接种量9%、槐角底物浓度5%、转化时间2d,染料木素转化率达到3.5 mmol/L,并对染料木素发酵转化动力学模型进行了研究,其动力学模型为：y（t）=（?）进一步明晰了槐角染料木素裂褶菌发酵转化的主要转化途径：槐角苷中4′-葡糖苷被水解产生染料木素,在转化体系中79%染料木素的产生来源于槐角苷的水解。对槐角异樱黄素裂褶菌发酵转化进行了初步研究。明晰了槐角裂褶菌转化体系中异樱黄素的主要转化途径：槐角苷水解形成染料木素,染料木素5-OH甲氧基化形成异樱黄素。在优化后的异樱黄素发酵转化条件下,发酵12d,异樱黄素含量达到3.4mmol/L,其转化动力学模型为：y（t）=0.628+0.286×（t-2.5）,（t≥2.5）。利用Apelblat方程模型对染料木素在水、甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇和乙酸乙脂中的溶解度进行了测定及关联,发现Apelblat方程模型能较好的拟和溶解度实际数据并确定甲醇为提取染料木素溶剂。进一步利用经验模型对染料木素在不同甲醇溶剂体系中的溶解度进行了测定和关联,发现经验模型能较好的拟和染料木素在不同甲醇溶剂体系中的溶解度,依据该溶解度数据,确定槐角转化液中染料木素提取溶剂为75%终浓度的甲醇溶液。槐角发酵转化物对乳腺癌细胞增殖及凋亡的研究结果表明：槐角经裂褶菌转化后对人乳腺癌MCF-7（ER+）细胞抑制增殖作用增强,其抑制增殖活性物质主要存在于乙醇提取液中；转化主要产物染料木素和异樱黄素对MCF-7细胞的抗增殖影响均具有较好的剂量和时效相关性；在低剂量和高剂量下,异樱黄素抑制MCF-7细胞增殖活性强于染料木素,在10μmol/L下二者对MCF-7细胞增殖抑制率相当（约50%）；通过形态学观察表明异樱黄素明显促进MCF-7细胞的凋亡,并通过PI单染流式检测表明,异樱黄素作用72 h后促进MCF-7细胞的凋亡,凋亡率为12.1%,异樱黄素作用MCF-7细胞主要阻滞细胞于G1-S期；异樱黄素对MCF-7细胞的促凋亡作用通过检测caspase-3、PARP表达得以相互印证,从而证实caspase-3介导凋亡是异樱黄素引起MCF-7细胞凋亡的途径之

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 乳腺癌与动物雌激素
• 1.2 植物雌激素
• 1.3 异黄酮的生物转化
• 1.4 槐角及槐角黄酮
• 1.5 课题思路的提出
• 1.6 本论文主要研究内容
• 2 槐角异黄酮生物转化食药用真菌的筛选
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 结果与分析
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 3 槐角裂褶菌生物转化主要产物的分离纯化及结构鉴定
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.3 结果与分析
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 4 槐角染料木素裂褶菌生物转化研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.3 结果与分析
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 5 槐角异樱黄素裂褶菌生物转化初步研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.3 结果与分析
• 5.4 小结
• 6 染料木素溶解度的测定及关联
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.3 结果与分析
• 6.4 小结
• 7 槐角裂褶菌转化产物抗乳腺癌细胞活性研究
• 7.1 引言
• 7.2 材料与方法
• 7.3 结果与分析
• 7.4 讨论
• 7.5 小结
• 8 全文总结
• 8.1 全文主要研究结果
• 8.2 创新性方面
• 8.3 全文不足之处
• 8.4 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录1 攻读学位期间发表论文情况
• 附录2 攻读学位期间申请专利情况