Escherichia coli表达系统中硒代半胱氨酸表达效率的测定及表达条件优化

论文摘要

硒是人体必需的微量元素之一。在生物体内，它主要是通过构成各种含硒酶来发挥作用，且以硒代半胱氨酸（selenocysteine，Sec）的形式作为酶的催化基团。Sec由终止密码子UGA编码，以共翻译的形式插入到新生肽链中，又被称为第21种氨基酸。Sec在原核生物中涉及一个顺式作用元件和四个基因产物。在Escherichia coli中，Sec的表达效率只有正常氨基酸的1—3％。基因元件selA，selB和selC基因参与了Sec的掺入过程，我们考察三者单独或者一起与硒蛋白基因共表达时，Sec通读效率的变化。在本文的前期工作中，已经成功完成了含硒谷胱甘肽硫转移酶在大肠杆菌中的表达和GFP／pET-32b报告载体系统的构建及表达。在本文工作中，我们完成了另一报告载体GFP／pUC18的构建及表达，并通过两种报告系统，即绿色荧光蛋白（GFP）和β-半乳糖苷酶，来检测Sec的通读效率并加以比较以探索更好地Sec表达条件。与β-半乳糖苷酶相比，GFP测定UGA的通读效率更为方便、快捷。在测定Sec通读效率方面两个表达系统得到的结果基本相似。但是，用GFP报告系统定量测定UGA密码子与有义密码子的通读效率比值却比以β-半乳糖苷酶测定的比值小得多。这是由于GFP处于强启动子控制之下，使得荧光强度的增加与其分子数的增加不成线性关系，不利于wt-GFP的定量对比分析。我们尝试使用较弱lac启动子解决了这一问题，但同时，由于Sec-GFP的翻译效率大大降低，在lac启动子启动下，其荧光值低于荧光检测仪的灵敏度，也无法用于定量分析。鉴于GFP报告系统的缺陷，接下来我们使用β-半乳糖苷酶报告系统检测Sec的通读效率。结果表明，与Sec单独表达时相比，当与selC基因共表达时，Sec的通读效率增加了40％。而与selA，selB和selC基因共表达时，UGA的通读效率增加至2.2倍。这与GFP报告系统结果相符合。但是Sec基因只与selA或selB基因共表达时，Sec的通读效率分别下降了39％和89％。这表明selA和selB基因不但没有促进反而抑制了Sec的通读。而当与selB和selC基因共表达时，Sec的通读效率增加了11％，在此基础上增加selA基因的表达，通读效率降低了29％。因此，我们推测SelA和SelB对于Sec的通读具有反馈抑制的作用，这样可以调节Sec的过量表达。SelB可以在一定程度上抑制SelA蛋白的表达水平，同时也由于自身的过量导致翻译的终止加强，Sec通读效率的大幅度下降。可见在Sec的插入过程中，SelA、selB和selC是综合作用的，不是提高某一个基因的量就会促进Sec的表达，有时反而会产生抑制作用。只有调节好三者的相对量才能获得最适宜的Sec表达条件。通过构建一系列的表达载体，测定Sec的表达效率，我们发现，共表达selAB，selC基因时，Sec掺入效率提高了5.46倍。而目前文献报道的效率较高的Sec表达体系（共表达selA，selB和selC基因）仅可以使表达效率提高2.2倍。可见我们的方法更有利于Sec的掺入，也更能促进硒蛋白的表达。

论文目录

• 提要
• 第一章 前言
• 一、硒蛋白概述及其生物学作用
• 1.硒蛋白
• 2.硒蛋白的生物学作用
• 二、硒代半胱氨酸插入机制
• 1.原核生物的硒代半胱氨酸插入元件
• 2.真核生物的硒代半胱氨酸插入元件
• 3.硒蛋白的原核表达
• 三、谷胱甘肽硫转移酶
• 四、绿色荧光蛋白
• 1.发展历史
• 2.GFP的性质
• 3.GFP的改进
• 4.GFP的应用研究进展
• 5.问题与展望
• 五、β-半乳糖苷酶
• 1.发展历史
• 2.β-半乳糖苷酶性质
• 3.β-半乳糖苷酶的应用
• 六、本论文的设计目的
• 参考文献
• 第二章 报告载体及sel系列基因的构建表达
• 一、实验材料及方法
• 1.实验材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 质粒和菌株
• 1.3 主要仪器
• 1.4 培养基和主要溶液的配制
• 2.实验方法
• 2.1 质粒的提取
• 2.2 DNA片段的酶切与连接
• 2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.4 连接产物的转化
• 2.5 阳性克隆的筛选及其鉴定
• 2.6 重组质粒及其菌种的保存
• 2.7 sel系列基因的获得及载体的构建
• 二、结果与讨论
• 1.sel系列基因的获得及载体的构建
• 2.sel系列基因的表达
• 参考文献
• 第三章 利用两种报告基因检测sel系列基因对Sec插入效率的影响
• 第一节 利用绿色荧光蛋白定量测定硒代半胱氨酸的通读效率
• 一、实验材料及方法
• 1.实验材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.4 菌株和质粒
• 1.4 主要溶液的配制
• 2.实验方法
• 2.1 质粒的转化
• 2.2 检测Sel系列基因与GFP共表达对硒代半胱氨酸的通读效率的影响
• 2.3 分子荧光测定
• 二、结果与讨论
• 1.GFP/pUC18系列载体的构建
• 2.检测Sel基因与GFP共表达对Sec通读效率的影响
• 第二节 利用β-半乳糖苷酶定量测定硒代半胱氨酸的通读效率
• 一、实验材料及方法
• 1.实验材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 菌株和质粒
• 1.4 主要溶液的配制
• 2.实验方法
• 2.1 Sel系列基因与β-半乳糖苷酶共表达对硒代半胱氨酸的通读效率的影响
• 2.2 硒代半胱氨酸插入表达条件的优化
• 2.3 β-半乳糖苷酶活力的检测
• 二、结果与讨论
• 1.低浓度诱导时selA,selB与selC基因的共表达对Sec插入效率的影响
• 2.优化最佳的Sec插入表达条件
• 参考文献
• 摘要
• ABSTRACT
• 致谢