蝎神经性毒素ANEP、AGAP的原核表达及毒力测定

论文摘要

由于人类不合理的经营,常常导致森林病虫害周期性大发生,不仅给林业生产带来巨大的经济损失,而且还威胁着生态平衡。在森林害虫防治中以往多采用化学药剂,长期使用化学防治不仅导致害虫产生耐药性,而且用药量越来越大,形成恶性循环,对自然生态平衡造成严重的破坏,直接威胁着人、畜的安全,同时也增加了防治难度和资金的投入。抗病虫基因工程的发展为防治病虫害开辟了一条新途径,对于植物的保护作用具有持续性,大大降低了病虫害的抗药性和对环境的污染,有效维护了生物多样性和生态平衡。本文对东亚钳蝎昆虫毒素ANEP、AGAP在大肠杆菌BL-21中的最佳表达条件以及两种蝎神经性毒素实验室毒力测定进行研究,得出实验结果如下:1.重组蛋白ANEP的理论分子量为15169.572 Da,Ala、,Cys、Gly和Thr分别占31.25%、13.02%、29.68%、26.04%;AGAP的理论分子量为15786.402 Da,其中Ala占30.3%,Cys占15.15%,Gly占28.78%,Thr占25.75%。2.利用琼脂糖凝胶电泳对重组菌进行筛选,得到分布在标准DNA片断100bp到250bp之间的扩增基因条带,重组质粒成功转化到表达菌体中。3.通过均匀设计实验,得出蝎神经性毒素ANEP最佳表达条件为:表达时间6h,诱导物浓度1mmol/L,菌液比例1:50,菌液OD值0.7;得出蝎神经性毒素AGAP的最佳表达条件为:表达时间6h,诱导物浓度0.5mmol/L,菌液比例1:100,菌液OD值0.5。4.蝎神经性毒素ANEP 200倍稀释液对于分月扇舟蛾,榆紫叶甲,落叶松毛虫的校正死亡率分别为84.48%,79.31%,83.05%;蝎神经性毒素AGAP 200倍稀释液对于分月扇中蛾,榆紫叶甲,落叶松毛虫的校正死亡率分别为82.76%,68.97%,81.36%。5.2种蝎神经性毒素重组蛋白对3种森林害虫均具有一定的杀虫效果,但ANEP杀虫效果均好于AGAP。AGAP对分月扇舟蛾的效果最佳,5种浓度的幼虫死亡率为51.72%—84.48%,对榆紫叶甲幼虫的毒力最差。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 课题背景
• 1.1.1 蝎神经性毒素的研究进展
• 1.1.2 蝎昆虫毒素在生物防治上的研究
• 1.1.3 蝎昆虫毒素的作用机理与分类
• 1.1.4 表达载体 pJUTRX
• 1.1.5 基因表达类型
• 1.1.6 基因表达系统
• 1.1.7 抗神经兴奋肽 ANEP
• 2 重组质粒的原核表达
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 细菌 LB 培养基
• 2.1.3 氨苄青霉素（100mg/ml）
• 2.1.4 主要溶液试剂
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 技术路线与试验方法
• 2.2.1 试验路线
• 2.2.2 感受态细胞的制备
• 2.2.3 重组质粒转化大肠杆菌 BL-21
• 2.2.4 重组质粒的小量制备
• 2.2.5 重组菌的筛选
• 2.2.6 重组蛋白的表达
• 2.2.7 重组蛋白表达条件优化设计
• 2.2.8 SDS-聚丙烯凝胶电泳分析诱导时间过程及表达量
• 2.2.9 Antheprot 蛋白质分析
• 2.2.10 BandScan 分析目的蛋白表达量
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 Antheprot 蛋白分子量
• 2.3.2 重组质粒转化大肠杆菌 BL-21
• 2.3.3 PCR 扩增结果
• 2.3.4 重组蛋白表达结果与 SDS-聚丙烯凝胶电泳分析
• 2.3.5 重组蛋白最佳表达条件
• 2.4 本章小结
• 3 蝎昆虫毒素的毒力
• 3.1 试验材料与设备
• 3.1.1 试验主要材料
• 3.1.2 试验试剂
• 3.1.3 供试昆虫
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 目的蛋白的大量表达
• 3.2.2 目的蛋白的裂解
• 3.2.3 毒力测定
• 3.2.4 试验数据分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 对分月扇舟蛾幼虫的毒力
• 3.3.2 榆紫叶甲的毒力测定
• 3.3.3 落叶松毛虫幼虫毒力测定
• 3.3.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢