细胞内金属离子荧光蛋白探针

论文摘要

金属离子广泛参与生命过程,与蛋白质大分子相互作用,在生命医学科学中扮演了非常重要的角色。离子的种类与价态等性质对它们的生理功能起决定性的影响,生命活动相关的各金属在细胞内有严格的浓度范围,过量或不足都会引起严重的疾病。因此,针对金属离子进行定性或定量的特异性检测对生命医学科学具有重要意义。常用的传统金属离子检测方法和小分子化学探针不能够实时动态地监测生物体内金属离子的状态和分布,若能克服这种局限针对金属离子进行定性或定量的特异性检测,将对生命医学科学具有重要意义。本文利用原核细胞中的转录调控蛋白CueR对金属选择性结合的特点,融合荧光蛋白突变体,利用基因工程的方法构建了一系列铜离子和银离子荧光蛋白探针样品,通过活菌体高通量筛选获得了对目的金属离子响应高选择性好的银离子探针和铜离子探针,可直接用于细胞内的动态检测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 金属离子与生命体
• 1.2 金属蛋白与金属感应
• 1.2.1 金属离子的使用与获取
• 1.2.2 细菌中的金属感应模式
• 1.2.3 酵母中的金属感应器
• 1.2.4 脊椎动物中的金属感应
• 1.3 荧光蛋白与融合探针
• 1.3.1 荧光蛋白的发现及重要研究里程碑
• 1.3.2 荧光蛋白的结构性质与突变体
• 1.3.3 荧光蛋白的应用
• 1.4 展望
• 第2章 实验材料与方法
• 2.1 菌株
• 2.2 质粒
• 2.3 试剂
• 2.3.1 酶
• 2.3.2 分子生物学实验相关试剂
• 2.3.3 蛋白表达与纯化相关试剂
• 2.3.4 金属盐
• 2.4 主要实验仪器
• 2.5 主要试剂配制
• 2.6 常规实验过程
• 2.6.1 克隆目的基因,构建原始质粒
• 2.6.2 目的蛋白的表达与纯化
• 第3章 基于CueR的铜离子荧光蛋白探针
• 3.1 CueR与铜离子
• 3.2 研究基础
• 3.2.1 探针模型
• 3.2.2 质粒构建
• 3.3 实验与结果分析
• 3.3.1 H131,H132位点突变以提高探针选择性
• 3.3.2 活菌检测方法的建立
• 3.3.3 对acb模型单截短和正交截短质粒进行亚铜离子活菌检测
• 3.3.4 针对荧光蛋白的截短探针筛选
• 3.3.5 替换融合探针中的荧光蛋白以提高响应
• 3.3.6 在acb-C1N5基础上进行129/130位双突变
• 3.3.7 112、120位Cys突变
• 3.3.8 构建真核质粒与检测
• 3.4 本章小结
• 第4章 基于CueR的银离子荧光蛋白探针
• 4.1 CueR与银离子
• 4.2 对pRSETb-acb模型截短质粒的银离子活菌筛选
• 4.3 acb-C1N5的选择性优化
• 4.3.1 高通量筛选方法的建立
• 4.3.2 对以acb-C1N5为模板的突变体进行高通量筛选
• 4.3.3 构建真核质粒及哺乳动物细胞检测
• 4.4 银离子探针acb-C1N5A118P的性质研究
• 4.5 本章小结
• 第5章 铁离子荧光蛋白探针
• 5.1 基于Fur的铁离子荧光蛋白探针
• 5.1.1 克隆目的基因与构建原始质粒
• 5.1.2 融合探针表达与检测
• 5.2 基于IRP2的铁离子荧光蛋白探针
• 5.2.1 克隆目的基因与构建原始质粒
• 5.2.2 融合探针的表达与检测
• 5.3 本章小结
• 第6章 讨论
• 6.1 实验原理与模型设计
• 6.2 实验策略的选择
• 6.2.1 以活菌体为检测对象的筛选
• 6.2.2 点饱和突变与高通量筛选
• 6.3 实验结果与现象的讨论
• 6.3.1 基于CueR的金属离子探针
• 6.3.2 基于Fur的铁离子探针
• 6.3.3 基于IRP2降解结构域的铁离子探针
• 6.4 与其它金属离子探针的比较
• 6.4.1 与小分子化学探针
• 6.4.2 与现有的基因编码金属离子探针
• 6.5 酶标仪检测的可靠性
• 6.6 后续工作
• 第7章 结论
• 参考文献
• 致谢