脂肪酶的固定化及其催化性能的研究

论文摘要

脂肪酶是一类重要的生物催化剂,因其具有选择性高、催化反应条件温和、无污染等特点,广泛应用于食品加工、医药和精细化工等行业。然而,游离酶稳定性差,易失活,不能重复使用,并且反应后也不易与产品分离,使其难以实现规模化的工业生产。在此条件下,通过酶固定化技术来克服脂肪酶应用的局限成为酶工程领域研究的热点。本论文采用多种方法对假单胞菌脂肪酶（PSL）进行了固定化,并将制备的固定化酶应用于催化拆分两个重要的手性中间体—（S）-2-[（2-甲基-6-乙基）苯基氨基]丙酸（NEMPA）和（S）-2-辛醇。首先选用了介孔分子筛和大孔树脂为载体进行酶的固定化研究。通过载体种类的筛选以及对载体性能和固定化条件的优化,获得了三种固定化酶（SBA-15-PSL,EC-EP-PSL和HP20-PSL）,并对固定化过程的动力学以及固定化机理做了进一步探讨。另外,还采用无载体的固定化方法制备了两种脂肪酶的交联聚集体（CLEAs-PSL）。脂肪酶固定化后,对温度和pH的敏感性有所降低,在水相和有机相中的操作稳定性以及储藏稳定性有了明显的提高。经筛选得到的几种固定化酶,在两个拆分体系中的反应速度、催化活性以及对环境的耐受性较游离酶均有显著的改善,并能够在保持活性和立体选择性不变的情况下多次重复使用,初步解决了游离酶使用过程中遇到的问题,为其它酶类的固定化以及脂肪酶的工业化应用奠定了基础。

论文目录

• 提要
• 第一章 前言
• 1.1 酶与手性
• 1.1.1 手性的研究意义及重要性
• 1.1.2 手性化合物的制备
• 1.1.3 酶在手性技术上的应用
• 1.2 脂肪酶
• 1.2.1 脂肪酶的概述
• 1.2.2 脂肪酶的活性部位结构及其催化机理
• 1.2.3 脂肪酶催化拆分
• 1.2.4 脂肪酶在应用中存在的问题
• 1.3 固定化酶
• 1.3.1 固定化酶的概述
• 1.3.2 酶的固定化方法
• 1.3.2.1 吸附法
• 1.3.2.2 包埋法
• 1.3.2.3 共价法
• 1.3.2.4 交联法
• 1.3.3 固定化酶的制备原则
• 1.3.4 固定化酶的性质
• 1.3.5 酶固定化过程中存在的问题
• 1.4 本文的研究思想与主要内容
• 1.5 参考文献
• 第二章 介孔分子筛固定化脂肪酶的研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要仪器
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 脂肪酶溶液的制备
• 2.2.4 脂肪酶的固定化
• 2.2.5 脂肪酶的活力测定
• 2.2.6 蛋白含量的测定
• 2.2.7 固定化脂肪酶的活力回收和固定化率
• 2.2.8 分子筛SBA-15 的合成与表征
• 2.2.9 分子筛SBA-15 的表面修饰
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 固定化载体的选择
• 2.3.2 SBA-15 的合成与表征结果
• 2.3.3 对SBA-15 载体的改性研究
• 2.3.3.1 SBA-15 载体的表面修饰
• 2.3.3.2 含不同模板量的SBA-15 的制备
• 2.3.4 固定化条件对SBA-15（48）固定化酶的影响
• 2.3.4.1 酶浓度对脂肪酶固定化的影响
• 2.3.4.2 环境pH 对脂肪酶固定化的影响
• 2.3.4.3 缓冲液离子强度对脂肪酶固定化的影响
• 2.3.4.4 固定化时间对脂肪酶固定化的影响
• 2.3.5 固定化酶的表征
• 2.3.6 固定化酶的紫外光谱
• 2.3.7 固定化过程分析
• 2.4 结论
• 2.5 参考文献
• 第三章 大孔树脂对脂肪酶的固定化研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 HP20 固定化脂肪酶
• 3.2.3 EC-EP固定化脂肪酶
• 3.2.4 EC-EP载体活化度的测定
• 3.2.5 蛋白含量的测定
• 3.2.6 吸附曲线的绘制
• 3.2.7 固定化脂肪酶的活力测定
• 3.2.8 固定化脂肪酶的固定化效率和活力回收
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 载体的筛选
• 3.3.2 HP20-PSL固定化条件的优化
• 3.3.3 HP20-PSL的吸附平衡等温线
• 3.3.4 HP20-PSL吸附过程的动力学研究
• 3.3.5 HP20-PSL的固定化历程
• 3.3.6 EC-EP对脂肪酶的固定化
• 3.3.7 EC-EP载体活化度的优化
• 2-PSL固定化条件的优化'>3.3.8 EC-EP-NH₂-PSL固定化条件的优化
• 2 固定化脂肪酶的机理研究'>3.3.9 EC-EP-NH₂固定化脂肪酶的机理研究
• 3.4 结论
• 3.5 参考文献
• 第四章 交联脂肪酶聚集体的制备
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 脂肪酶的固定化
• 4.2.3 CLEAs红外光谱的测定
• 4.2.4 固定化脂肪酶的活力测定
• 4.2.5 蛋白含量的测定
• 4.2.6 固定化脂肪酶的固定化效率和活力回收
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 沉淀剂的选择
• 4.3.2 CLEAs制备条件的优化
• 4.3.2.1 酶浓度对CLEAs的影响
• 4.3.2.2 沉淀剂用量对CLEAs的影响
• 4.3.2.3 交联剂的加入量对CLEAs的影响
• 4.3.2.4 交联时间对CLEAs的影响
• 4.3.3 表面活性剂对CLEAs的影响
• 4.3.4 CLEAs的红外光谱
• 4.3.5 戊二醛在CLEAs制备过程中的反应机理
• 4.4 结论
• 4.5 参考文献
• 第五章 固定化酶酶学性质的研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 温度对固定酶的影响
• 5.2.3 pH对固定化酶的影响
• 5.2.4 金属离子对固定化酶的影响
• 5.2.5 固定化酶的相对活力
• 5.2.6 固定化酶的剩余活力
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 温度对固定化酶活性和稳定性的影响
• 5.3.2 pH对固定化酶活性和稳定性的影响
• 5.3.3 金属离子对固定化酶活性的影响
• 5.3.4 固定化酶在水相和有机相中的稳定性
• 5.3.5 固定化酶的储藏稳定性
• 5.4 结论
• 5.5 参考文献
• 第六章 固定化脂肪酶催化拆分2-[（2-甲基-6-乙基）苯基氨基]丙酸的研究
• 6.1 引言
• 6.2 材料和方法
• 6.2.1 仪器和药品
• 6.2.2 背景电解质溶液和样品溶液的配制
• 6.2.3 实验方法
• 6.2.4 NEMPA 转化率（C）的检测
• 6.2.5 NEMPA 对映体过量值（e.e.p）的检测
• 6.2.6 立体选择性比率（E）的计算
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 固定化酶的筛选
• 6.3.2 Ac-CLEA和EC-EP固定化酶催化拆分NEMPA
• 6.3.2.1 温度对催化拆分的影响
• 6.3.2.2 pH对催化拆分的影响
• 6.3.2.3 固定化酶加入量对催化拆分的影响
• 6.3.2.4 催化拆分NEMPA的反应进程
• 6.3.2.5 催化拆分NEMPA的动力学分析
• 6.3.3 固定化酶的重复使用
• 6.3.4 有机溶剂对固定化脂肪酶活性和立体选择性的影响
• 6.3.5 表面活性剂对固定化脂肪酶活性和立体选择性的影响
• 6.4 结论
• 6.5 参考文献
• 第七章 固定化脂肪酶催化拆分手性2-辛醇的研究
• 7.1 引言
• 7.2 材料和方法
• 7.2.1 主要试剂和仪器
• 7.2.2 酶催化（R,S）-2-辛醇的酯交换反应
• 7.2.3 底物转化率的测定
• 7.2.4 2-辛醇的光学纯度（e.e.）的测定
• 7.2.5 立体选择性比率（E）的测定
• 7.2.6 产物的分离
• 7.3 结果与讨论
• 7.3.1 固定化酶的筛选
• 7.3.2 固定化酶拆分2-辛醇反应条件的确定
• 7.3.3 提高固定化酶拆分2-辛醇的催化活性和立体选择性
• 7.3.3.1 固定化酶的水含量
• 7.3.3.2 有机溶剂
• 7.3.4 固定化酶拆分2-辛醇的反应进程
• 7.3.5 固定化酶的重复使用
• 7.4 结论
• 7.5 参考文献
• 攻读博士期间的主要成果
• 摘要
• Abstract
• 致谢