论文题目: 基因沉默技术(RNAi)沉默肿瘤多药耐药基因的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 病理学与病理生理学
作者: 干惠珠
导师: 张桂珍
关键词: 肿瘤,细胞株,细胞株,发卡,表达载体,多药耐药,基因治疗
文献来源: 吉林大学
发表年度: 2005
论文摘要: 目的siRNAs(Short interfering RNAs)在哺乳动物体内能够介导序列特异性基因表达的抑制。最近载体介导合成短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)的方法取得一些进展。MDR1 基因产物P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)过表达导致肿瘤细胞多药耐药(Multidrug resistance,MDR)。本研究利用发卡siRNA 表达载体转染耐药的人乳腺癌株(MCF-7/AdrR) 和人红白血病细胞株(K562/ADM)逆转肿瘤多药耐药。方法构建2 个发卡siRNA 表达载体,分别转染MCF-7/AdrR 和K562/ADM 细胞。RT-PCR分析MDR1 mRNA 的表达, Western Blot、免疫细胞化学方法和流式细胞术分别检测P-gp 的表达,流式细胞术和MTT 法分别检测MCF-7/AdrR 和K562/ADM 细胞的凋亡、细胞内罗丹明(Rh123)的浓度以及对阿霉素的敏感性,激光共聚焦荧光显微镜测定细胞内柔红霉素的稳态积累。结果在转染MDR1-A 和MDR1-B 发卡siRNA 表达载体的MCF-7/AdrR 细胞,RT-PCR 检测结果显示MDR1 基因mRNA 表达分别减少到40.9 % (P < 0.05),30.1% (P < 0.01) (瞬时转染) 和37.6 % (P < 0.05),28.0 % (P < 0.01) (稳定转染);在K562/ADM 细胞,MDR1 基因mRNA 表达分别减少到39.1 % (P < 0.05),30.8% (P < 0.01)(瞬时转染)和35.9 % (P < 0.05),27.5 % ( P < 0.01)(稳定转染)。Western Blot、免疫细胞化学方法和流式细胞术检测结果均显示MCF-7/AdrR 和K562/ADM 细胞P-gp 表达被明显而特异地抑制。转染后MCF-7/AdrR 细胞对阿霉素的耐药性由162-fold 减低到109-fold, 54-fold (瞬时转染) 和108-fold, 50-fold (稳定转染);K562/ADM 细胞对阿霉素的耐药性由79-fold 减低到39-fold, 34-fold (瞬时转染)和38-fold, 30-fold (稳定转染)。并且发卡siRNA 表达载体增加MCF-7/AdrR
论文目录:
英文缩写单词表
前言
实验一 MDR1 发卡siRNA 表达载体的构建及鉴定
一 材料和方法
(一) 材料
(二) 方法
二 结果
(一) MDR1 发卡siRNA 表达质粒的酶切鉴定
(二) MDR1 发卡siRNA 表达质粒的测序结果
(三) MDR1 发卡siRNA 表达质粒的纯度及含量测定
实验二 MDR1 发卡siRNA 表达载体的转染
一 材料和方法
(一) 材料
(二) 方法
二 结果
(一) 发卡siRNA 表达质粒转染K5622/ADM、MCF7/AdrR 细胞
(二) 转染发卡siRNA 表达质粒对细胞生长的影响
(三) LSFM 检测pcDNA3.0 EGFP 和siGFP 发卡siRNA 表达质粒共转染在耐药细胞中的表达情况
(四) 流式细胞术检测pcDNA3.0 EGFP 和siGFP 发卡siRNA表达质粒共转染在耐药细胞中的表达情况
实验三 MDR1 发卡siRNA 表达载体抑制MDR1 基因表达的研究
一 材料和方法
(一) 材料
(二) 方法
二 结果
(一) 发卡siRNA 表达载体抑制MDR1 基因mRNA 的表达
(二) 发卡siRNA 表达载体抑制P-gp 蛋白表达
(三) 免疫细胞化学检测转染MDR1-A 和 MDR1-B 发卡siRNA载体对 P-gp 表达的影响
(四) 流式细胞术化学检测转染 MDR1-A 和 MDR1-B 发卡5iRNA 载体对 P-gp 表达的影响
实验四 MDR1 发卡siRNA 表达载体对化疗药物敏感性及P170 泵功能影响的研究
一 材料和方法
(一) 材料
(二) 方法
二 结果
(一) MTT 法细胞毒检测
(二) 流式细胞仪检测细胞凋亡
(三) 细胞内柔红霉素稳态积累的检测
(四) 流式细胞仪测定细胞内 Rh123 浓度
讨论
结论
综述一 肿瘤多药耐药及其逆转的研究进展
综述二 RNA 干扰技术研究进展
参考文献
博士研究生期间取得的研究工作成果
附 图
中文摘要
ABSTRACT
致 谢
发布时间: 2005-08-26
参考文献
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