（新疆医科大学第一附属医院新疆乌鲁木齐830054）
【摘要】目的：筛选预测维吾尔族局部晚期食管癌患者的血清差异蛋白。方法：收集维吾尔族局部晚期的食管鳞癌患者28例，采集维吾尔族食管癌患者接受放化疗前后的静脉血，同时收集健康对照组血，对各组血清进行iTRAQ标记及蛋白质谱检测，最后通过蛋白分析软件筛选差异蛋白。结果：放化疗前后食管癌患者与健康对照组比对，分别筛选出83个、112个差异蛋白，患者放化疗前组与放化疗后组比对，共筛选出24个差异蛋白。结论：SAA、补体、组蛋白、CRP等，与既往研究结论相似，进一步证实了本研究结果可靠性。有些近年来研究热门的新蛋白如胰岛素样生长因子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)等，对诊断肿瘤及研究肿瘤侵袭性有很大意义，且IGF被认为与肿瘤的化疗抵抗相关。
【关键词】食管癌；放化疗；蛋白；维吾尔族
【中图分类号】R681.53【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2018）15-0395-02
CharacteristicsofDifferentialProteinofXinjiangUygurPatientswithEsophagealcancer
YangMei,ZhangJianqing,LuoWei,WangXiao,LiuJuan,ZhangLi.
Thefirstaffiliatedhospitalofxinjiangmedicaluniversity,Urumqi,830054,China
【Abstract】ObjectiveToscreenandpredicttheserumdifferentialproteinofUygurpatientswithlocallyadvancedesophagealcancer.MethodsTocollect28patientswithlocallyadvancedesophagealsquamouscellcarcinoma,collectthevenousbloodbeforeandafterthechemoradiotherapyofUygurpatientswithesophagealcancer.TheserumofeachgroupwasiTRAQlabeledandprotein-spectrumtested,andthenthedifferentialproteinwasscreenedbytheproteinanalysissoftware.ResultsComparedthehealthygroupwiththepatientswithesophagealcancerbeforeandafterthechemoradiotherapy,respectively83,112differentialproteinswerescreenedout;Comparedtheesophagealcancerbeforeandafterthechemoradiotherapy,24differentialproteinswerescreenedout.ConclusionSAA,complement,histone,CRP,etc.,weresimilartopreviousstudies,andfurtherconfirmedthereliabilityofthisstudy.Somerecentresearchhotnewproteinssuchasinsulin-likegrowthfactor,glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase(GAPDH),researchondiagnosisoftumorandtumorinvasivehasgreatsignificance,andIGFarethoughttobeassociatedwithtumorchemotherapyresistance.
【Keywords】Esophagealcancer;Chemoradiotherapy;Protein;Uygur
肿瘤患者的体液中如血清或血浆就是可靠的标记物来源。理想的蛋白标记物应具有很高的特异性和敏感性，所应用的技术可靠、快速和经济；标本中含有的标记物容易获得。我们曾应用蛋白组学技术发现哈萨克族食管癌患者的差异蛋白及放化疗前后的差异蛋白表达，并发现APOC2（载脂蛋白2）、APOC3（载脂蛋白3）、AT-III（抗凝血酶III）在哈萨克族食管癌中异常表达[1]。在此基础上，我们将对维吾尔族局部晚期食管癌患者的血清差异蛋白进行筛选，试图发现具有预测食管癌的分子标记物。
1.材料与方法
1.1材料收集
收集新疆医科大学第一附属医院2014年6月—2015年6月收治的临床分期为III～IVA期的维吾尔族食管鳞癌患者28例。选取性别、年龄等相匹配的维吾尔族健康体检者14例作为对照组。采集接受放化疗前食管鳞癌患和健康体检者外周静脉血5ml，所有食管癌患者完成同期放化疗后，按照随访时间长短再次采集静脉血5ml。所有病例均经胃镜活检，组织病理确诊为鳞状细胞癌，分期为III～IVA期食管癌患者，一般状况(PS)评分≤2分。所有患者预计生存期≥6个月，无主要器官功能障碍，心、肺、肝、肾功能基本正常。
同期放化疗方案：化疗方案：FP方案：5-FU(氟尿嘧啶)（750～1000mg/m2）+DDP(顺铂)(75～100mg/m2)，3～4周一次。所有的患者先行同步放化疗，放疗结束后然再序贯化疗，直至完成共4～6周期化疗。如近期疗效评价为有效，继续原化疗方案。如评价为无效，则改用TP方案：紫杉醇(135～150mg/m2)/多西他赛(75mg/m2)+卡铂(AUC5-6)/顺铂(75mg/m2)。放疗方案：三维适形放疗或调强放疗，DT50～60Gy/2Gy/25～30f。
1.2方法
采用同位素标记相对和绝对定量技术（iTRAQ)，该技术通过蛋白质提取、消化，利用多种同位素试剂标记蛋白多肽，然后用高精度质谱仪串联分析，筛选综合治疗前后食管癌患者及健康对照者血清蛋白质谱表达差异。
1.3血清差异蛋白的筛选标准
按对比要求进行组间比较，组间比值大于1.2（表达上调）或小于0.833（表达下调），P<0.05为差异蛋白的筛选标准。其中组间比值大于1.5为显著表达上调，组间比值小于0.6为显著表达下调，对筛选的差异蛋白进一步在http://www.uniprot.org进行验证。
2.结果
（1）局部晚期维吾尔族食管癌患者放化疗前组与健康对照组血清差异蛋白的筛选
食管癌患者放化疗前组（B）与健康对照组（N）比对，共筛选出83个差异蛋白，上调蛋白有48个，下调蛋白有35个，其中显著表达上调（比值大于1.5）的蛋白有α微管蛋白(TUBA)、C-反应蛋白(CRP)、分泌性磷蛋白24（SPP24）、cDNAFLJ54184、cDNAFLJ41552fis、组蛋白H2B、溶菌酶C（LYSC）、胰岛素样生长因子结合蛋白1（IGFBP1）、组蛋白H2A1H型（H2A1H）、血清淀粉样蛋白P（SAMP）组分。显著表达下调（比值小于0.6）的蛋白有转铁蛋白(TF)、补体C4A3(C4A3)、激肽原1(KNG1)、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H1和H2、凝血因子XI。
（2）局部晚期维吾尔族食管癌患者放化疗后组与健康对照组血清差异蛋白的筛选
食管癌患者放化疗后组（A）与健康对照组（N）比对，共筛选出112个差异蛋白，上调蛋白有60个，下调蛋白有52个，其中显著表达上调（比值大于1.5）的蛋白有CRP、cDNAFLJ75416、DEF1、cDNAFLJ54184、组蛋白H2A1-H型、Q5HV83等。显著表达下调（比值小于0.6）的蛋白有转铁蛋白变体(片段)、富含组氨酸糖蛋白、激肽原1、补体C4A3、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H1和H2、B2R8I2等。
（3）局部晚期维吾尔族食管癌患者放化疗前组与放化疗后组差异蛋白筛选
食管癌患者放化疗前组（B）与放化疗后组（A）比对，共筛选出24个差异蛋白，上调蛋白有6个，下调蛋白18个，其中显著表达上调（比值大于1.5）的蛋白有补体C1q亚成分B组、Ig重链可变区、CRP。
3.讨论
食管癌诱发因素很多，除了和不良的生活习惯、营养不良、遗传有关外，还有学者证实和幽门螺杆菌有一定相关性[2]。很多患者就诊时已为晚期，失去手术机会，如何能找到特异性的标记物，做到早期诊断，成为目前研究的重点。我们试图通过简单的血清学检测蛋白方法，寻找可靠的分子标记物。
我们研究发现，通过对局部晚期食管鳞癌差异蛋白的筛选，筛选出大量差异蛋白，然而，如何从众多的分子蛋白中筛选出可能有诊断及放化疗疗效的预测价值的指标是目前比较棘手的问题，查阅相关文献提示差异倍数值越高的指标诊断及预测价值越大。因此，我们通过比较分子蛋白治疗前、治疗后组中的差异表达倍数，选择本数据中差异表达倍数最高，即比值大于1.5表达显著上调或比值小于0.6表达显著下调，且P值<0.05的指标，同时结合相关文献报道，在上述表达差异明显的分子蛋白中挑选了转铁蛋白变体、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H1和H2、血清淀粉样蛋白A（SAA）、胰岛素样生长因子（insulin-likegrowthfactor，IGF）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)做进一步分析。
本研究中，转铁蛋白变异体在食管癌治疗前和治疗后与正常对照组比较是明显下调。研究显示转铁蛋白-转铁蛋白受体在介导肿瘤主动靶向治疗方面有着明显优势[3]，因此TF可以作为运送靶向治疗药物的工具来治疗肿瘤。研究表明TF的高表达被认为是乳腺癌预后良好的因素，而TF的低表达是乳腺癌发病的独立危险因素，而且和疾病相关生存期的显著降低关系密切。由此可见，恶性肿瘤患者可能继发此蛋白减少，不失为一种肿瘤标记物的参考指标。
间a-胰蛋白酶抑制剂(ITI)是一种血浆蛋白酶抑制剂家族，迄今为止，ITIH分子已被证明在炎症和癌变中起着特别重要的作用。有学者进行系统性评价，发现ITIH基因在多种人类实体肿瘤中明显下调，包括乳腺癌、结肠癌和肺癌。本研究中也证实间a胰蛋白酶抑制剂重链1、2均在食管癌治疗前后有明显下调，这与既往研究相符。我们有必要对食管癌ITIH基因的差异表达进行进一步研究，研究它的下调是否与食管恶性肿瘤的起始和/或进展有关。
血清淀粉样蛋白A(SAA)，我们研究显示，与正常对照组相比，在食管癌患者治疗前后SAA都有明显上调。SAA参与了多种恶性肿瘤的发生和发展。目前认为在炎症发生和发展的过程中SAA是早期的生物标志物。目前研究表明SAA与多种恶性肿瘤关系密切，如食管癌[4]、肺癌[5]等多种恶性肿瘤，是筛选恶性肿瘤的广谱分子标记物。
胰岛素样生长因子（insulin-likegrowthfactor，IGF），近年有学者报道胃癌、胰腺癌患者IGFBP-2会有明显升高，可作为肿瘤标记物的补充指标。在我们研究中食管癌患者IGFBP1、IGFBP2分别在食管癌治疗前和治疗后处于上调。对于此蛋白在食管癌发生中的关系，尚无相关报道，可进一步深入研究。
甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)在多种细胞功能中发挥着重要作用，包括代谢和基因转录。LiuK之前的研究表明，GAPDH的表达在结肠癌中升高，并在肝脏转移组织中进一步上调，提示GAPDH在促进癌转移方面可能发挥作用。在本研究中此蛋白在食管癌治疗后组是明显上调，这与既往研究报道此蛋白可能促进肿瘤增殖可能有一定相关，对于促进食管癌发生及预后因素方面，可进一步做基因调控，来重点研究。
总之，本研究初步筛选出了与维吾尔族食管癌关系密切的血清差异蛋白，其中一些蛋白的研究结果与其他研究相似，如：SAA、补体、组蛋白、CRP等，进一步证实了本研究结果可靠性。有些近年来研究热门的蛋白对诊断肿瘤及研究肿瘤侵袭性有很大意义。由于本研究初筛发现这些蛋白与食管癌有一定相关，可以进一步增加样本量，在组织中得到验证，并进一步作为靶基因调控进行通路研究。
【参考文献】
[1]CuiLi,GuoXia,ZhangLi,etal.SerumdifferentialproteinidentificationofXinjiangKazakhesophagealcancerpatientsbasedonthetwo-dimensionalliquid-phasechromatographyandLTQMS[J].MolBiolRep,2014,41(5):2893.
[2]孟庆华.幽门螺杆菌感染与食管癌的临床病理分析[J].新疆医学，2013,6（43）：114-115.
[3]陈玥琦，刘毅敏，张定林.转铁蛋白-转铁蛋白受体抗肿瘤作用研究进展[J].实用肿瘤学杂志.2015,29（1）：65-68.
[4]Jun-YeWang,Yu-ZhenZheng,JuanYang,etal,ElevatedlevelsofserumamyloidAindicatepoorprognosisinpatientswithesophagealsquamouscellcarcinoma[J].BMCCancer,2012,12:365.
[5]王胜，束新华，叶珍，等.血清淀粉样蛋白A在肺癌诊断中的应用[J].中华检验杂志，2016,39（3）：220-224.