Studies on the Citrus Tristeza Virus and Citrus Viroids in Pakistan

论文摘要

柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus, CTV）广泛分布于全世界各柑橘产区,由该病毒引起的柑橘衰退病是柑橘产业中最具毁灭性的病害之一。CTV属于长线形病毒科长线形病毒属的正义单链RNA病毒,主要存在于寄主韧皮部,可通过蚜虫以半持久方式进行短距离传播,或通过感病苗木调运进行远距离传播。CTV病毒粒子是弯曲的线状病毒,大小约为11 nm×2,000 nm,基因组大小约为19,300 nt,是迄今已知侵染植物的最大RNA病毒。其基因组RNA中包含12个开放阅读框（Open reading frames, ORFs）,大约可编码19种蛋白,在5’和3’末端各存在一段长度为107 nt和275 nt的非编码区（Untranslated regions, UTRs）。现已发现CTV株系或分离株有复杂的多样性,这些多样性造成了柑橘产生一系列的症状,如酸橙砧柑橘上的速衰、甜橙和葡萄柚等品种上的茎陷点和柠檬等品种上的苗黄等。茎陷点型衰退病已对许多柑橘易感品种构成了严重的威胁,如巴基斯坦潘洁普的甜橙、葡萄柚。经验表明,在一些强毒株系和褐色橘蚜共存的国家,弱毒株系交叉保护（Mild strain cross protection, MSCP）是预防柑橘品种免受茎陷点型CTV为害的最有效的方法。运用MSCP的前提是进行病害普查,并从中鉴定筛选有应用潜力的弱毒株系。本研究从巴基斯坦的潘洁普市的五个地区—argodha、Bhalwal、Sahiwal、Faisalabad和Toba Tek Singh分别采集柑橘样品,运用直接组织点免疫法（Directtissue blot immuno-assay, DTBIA）和反转录-聚合酶链式反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）技术初步筛选感染CTV的样品,然后将毒源嫁接接种于甜橙上,并保存于温室。通过对巴基斯坦CTV分离株主要外壳蛋白基因p25进行RT-PCR扩增,然后利用限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism, RFLP）和单链构象多态性（Single strand conformation polymorphism, SSCP）技术分析其p25/H/HinfⅠRFLP所属组群及其分子特征。随后,利用RT-PCR分别扩增从不同品种上收集到的21个分离株的4个基因（p23、p20、p18和p25）并进行测序,利用BioEdit和MEGA软件,对所采集样品与GenBank数据库中的国外代表性分离株的部分序列进行序列比对和系统进化发育分析,推断其遗传多样性和亲缘关系,从而为防治柑橘衰退病的弱毒株系交叉保护技术提供基础性数据支持。同时,本论文作者与另一博士生曹孟籍积极合作,还采用一步法RT-PCR技术对样品中的柑橘类病毒—柑橘裂皮类病毒（Citrus exocortis viroid, CEVd）,柑橘曲叶类病毒（Citrus bent leaf viroid, CBLVd）,啤酒花矮化类病毒（Hop stunt viroid, HSVd）,柑橘矮化类病毒（Citrus dwarfing viroid, CDVd）,柑橘树皮爆裂类病毒（Citrus bark cracking viroid, CBCVd）进行了检测。主要实验结果1 CTV样品的收集和检测2008年从巴基斯坦的Punjab市的五个地区共采集样品280份,运用DTBIA和RT-PCR方法共检测出85份样品感染了CTV。次年从巴基斯坦Punjab市的五个地区（Sargodha, Bhalwal, Sahiwal, Faisalabad and Toba Tek Singh）共采集样品260份,通过DTBIA和RT-PCR检测后,其中104份样品感染了CTV。2 CTV分离株RFLP和SSCP分析2.1 2008年和2009年所采样品的RFLP分析巴基斯坦的CTV分离株主要以p25/HinfⅠRFLP第3组群为主,其次为第1组群,感染率（单一组群和混合组群）分别为78.57%和28.57%,且未发现p25/Hinf I RFLP第7组群。通过检测所采得样品,CTV的混合组群率和单一组群率分别为35.6%和64.2%；在椪柑中的混合组群率为57%,单一组群率为43%；在甜橙中的混合组群率和单一组群率分别为35.7%和64.28%。2.22008和2009年所采样品的SSCP分析对所有单一毒源分离株及各分离株CTV的部分基因的不同克隆进行了SSCP分析,结果表明,大部分分离株均是在一个相同的主序列上产生的变化。3序列比对和遗传变异分析3.1序列比对分析实验所用到的21个CTV分离株,10个来自甜橙,1个来自甜株檬,10个来自椪柑。对这21个不同CTV分离株的4个基因（p23、p20、p18、p25）进行RT-PCR扩增并克隆测序。通过分析其核酸序列及其氨基酸序列的一致性,结果表明,21个分离株序列间的相似性在93.1%～100%（核苷酸序列）和89.8%～100%（氨基酸序列）。这些CTV分离株与CTV参考株系之间的相似性分别为69.6%～99.4%（核苷酸序列）和88.6%～98.2%（氨基酸序列）。值得说明的是,由于部分样品某些基因的克隆测序未获成功,因此实验中所测得的不同基因的序列并非均分别来自相同的样品。这些结果表明,在巴基斯坦潘洁普的CTV分离株序列一致性较为保守,但与其他国家（全部或部分）CTV分离株相比差异较大。序列相似性分析结果与先前报道的不同CTV株系的p25基因分析结果相似。3.2系统进化分析通过邻接法（Neighbor-joining method, NJ）推导出了每个基因核苷酸序列的系统进化树。使用相同方法,从氨基酸序列推导的系统进化树与从核苷酸序列推导的系统进化树相比,显示了相同的分组结果。此外,从氨基酸序列推导的系统进化树也得到了相同的结果。序列中核苷酸的变异程度决定了系统进化树各分支的长度。尽管存在寄主多样性和地理差异,但从巴基斯坦潘洁普得到的大多数CTV分离株都归到一个组群里。这些株系通过p18和p25基因建立的系统进化树显示较多的组群,而用p20和p23基因建立的系统进化树这些株系又被归到了一个组群。除分离株109、188和215外,用p20基因建立的系统进化树表明大多数的株系都被归到一个组群。分离株109距日本的NuagA（苗黄分离株）和加利福尼亚的SY568（速衰型和茎陷点型分离株）较近,分离株188和215距以色列的VT（速衰型和葡萄柚的茎陷点型分离株）较近。然而,用p23基因建立系统进化树表明,来自巴基斯坦潘洁普的分离株180、231、215,与报道过的其他国家株系VT、B165、SY568和NuagA相距很近。来自巴基斯坦潘洁普无症甜柠檬的分离株157,离其它所有组群和亚组最远。用p18和p25基因建立的系统进化树显示了更多的组群。用p18基因建立的系统进化树显示,来自巴基斯坦潘洁普的分离株242和来自中国的CT-9（弱毒分离物）很相近。并且,分离株109和180与T36和墨西哥-ctv（两种都是速衰型分离株）很相近。用p25基因建立的系统进化树发现,来自巴基斯潘洁普的分离株142和其它组群相距甚远,显示了很大差异。然而,分离株146又和来自以色列的VT相距很近。分离株T30、T385、T36和墨西哥-ctv紧密相关。同时,CT-9、NuagA、SY568分别和B165紧密相关。3.3氨基酸序列的矩阵分析对157分离株的p23基因进行了矩阵分析,结果显示,157分离株与中国的CT-9、西班牙的T385和美国佛罗里达的T30等弱毒株具有较大的相似性。p23基因中一些特异位点的多态性,将有助于我们区别弱毒株系和强毒株系。4生物学鉴定对11株来自巴基斯坦潘洁普地区的CTV分离株进行了生物学鉴定。使用六种指示植物：墨西哥莱蒙、邓肯葡萄柚/酸橙砧、凤凰柚/普通柚砧、西蒙斯甜橙/酸橙砧、西蒙斯实生苗和酸橙实生苗。11个CTV分离株中的10个在墨西哥莱蒙上表现出轻度至较严重的脉明和茎陷点症状。2个CTV分离株在邓肯葡萄柚和酸橙实生苗上表现出轻微和中度苗黄症状。各分离株在酸橙和凤凰柚上无明显的其它症状。两种分离株在西蒙斯甜橙上表现出茎陷点症状。结果显示：本实验中用到的CTV分离株可能多属于弱毒或中毒,一些株系有望用于弱毒株系交叉保护。5巴基斯坦潘洁普地区柑橘类病毒的初步鉴定于2008年采自于巴基斯坦潘洁普地区的样品中检测到类病毒。使用多重RT-PCR同时检测CEVd、CBLVd、HSVd、CDVd和CBCVd,扩增并克隆测序,测序结果在GenBank上进行BLAST比对,结果显示,分别有12、8、31和17份样品中带有CEVd、CBLVd、HSVd和CDVd。所有采到的样品中未检测到CBCVd的存在。结论本研究中检测了采自巴基斯坦潘洁普柑橘种植区的柑橘样品,检测出该地区有柑橘衰退病和类病毒发生,并对不同CTV株系的p25基因进行SSCP和RFLP分析。结果发现,大部分阳性样品仅感染了CTV的单一株系,用HinfⅠ限制性内切酶对其p25基因酶切进行RFLP分析,发现所采集的样品中CTV主要为第1组群和第3组群。运用RT-PCR扩增CTV的4个基因,克隆测序后,分别对其核苷酸序列及其氨基酸序列进行相似性分析、遗传进化与系统发育分析。通过比对分析发现,采集的所有CTV分离株均聚为单独的一类,且具有高度的同源性,同时来自不同地区的样品又存在一定的差异,具有相同生物学特性的株系往往聚为一类,表明巴基斯坦CTV分离株间存在较为复杂的遗传关系。进而对其不同分离株的致病性进行了鉴定及评价,生物学鉴定结果表明一些弱毒株系有望用于弱毒株系交叉保护。另外,本研究首次在巴基斯坦发现柑橘曲叶类病毒和柑橘矮化类病毒。

论文目录

• Acknowledgement
• Abstract
• 摘要
• CHAPTER 1 LITERATURE REVIEW
• 1.1. THE ORIGIN CENTER AND SPREAD OF CITRUS
• 1.2. THE DISTRIBUTION AND PREVIOUS RESEARCHES OF CTV
• 1.3. THE HOST RANGE OF CTV
• 1.4. SYMPTOMS INDUCED BY CTV
• 1.4.1 Quick decline or tristeza disease
• 1.4.2 Seedling yellows disease
• 1.4.3 Stem-pitting disease
• 1.5. THE TRANSMISSION APPROACH AND EPIDEMIOLOGY OF CTV
• 1.6. CONTROL STRATEGIES FOR CTV
• 1.7. CTV STRUCTURE, GENOME ORGANIZATION AND EXPRESSION
• 1.8. DIAGNOSIS OF CTV
• 1.8.1 Identification by Indicator Plants
• 1.8.2 Inclusion Identification by Electron Microscopy
• 1.8.3 Serological Identification
• 1.8.4 Polypeptide Mapping Analysis of Capsid Protein
• 1.8.5 Western Blot
• 1.8.6 dsRNA Electrophoresis Analysis
• 1.8.7 Northern Blot
• 1.8.8 RT-PCR Based Assays
• 1.8.9 RFLP Analysis
• 1.8.10 Single Strand Conformation Polymorphism （SSCP） Analysis
• 1.8.11 Sequence Analysis
• CHAPTER 2 #22IDENTIFICATION AND DISEASE INCIDENCE OF CTV ISOLATESCOLLECTED FROM PAKISTAN
• 2.1 INTRODUCTION
• 2.2 MATERIAL AND METHOD
• 2.2.1 Plant samples
• 2.2.2 Direct tissue blot immuno assay （DTBIA）
• 2.2.3 Nucleic acid extraction methods
• 2.2.4 Nucleic acid amplification by RT-PCR
• 2.3 RESULTS
• 2.3.1 Direct tissue blot immuno-assay
• 2.3.2 Synthesis of p25 by RT-PCR
• 2.3.3 Synthesis of cDNA of p18
• 2.3.4 Synthesis of cDNA of gene p20
• 2.4. DISCUSION
• CHAPTER 3 VARIABILITY AND SEQUENCE DIVERSITY OF CITRUS TRISTEZA VIRUSISOLATES FROM PAKISTAN
• 3.1 INTRODUCTION
• 3.2 MATERIAL AND METHODS
• 3.2.1 CTV isolates
• 3.2.2 cDNA synthesis and PCR amplification of p25, p23,p20 and p18
• 3.2.3 Cloning of PCR products
• 3.2.4 Nucleotide sequence and phylogenetic analysis
• 3.2.5 Nucleotide sequence accession numbers
• 3.3 RESULTS
• 3.3.1 Cloning and sequencing of the CTV isolates
• 3.3.2 Sequence identity analysis
• 3.3.3 Phylogenetic relationships between the isolates
• 3.3.4 Alignment of deduced amino acid sequences analysis
• 3.4 DISCUSION
• CHAPTER 4 CTV ISOLATES GROUP COMPOSITION ANALYSIS
• 4.1 INTRODUCTION
• 4.2 MATERIAL AND METHODS
• 4.2.1 Nucleic acid extraction
• 4.2.2 Nucleic acid amplification by RT-PCR
• 4.2.3 RFLP ananlysis of p25
• 4.2.4 SSSCP analysis of p25
• 4.3 RESULTS
• 4.3.1 Synthesis of p25 by RT-PCR
• 4.3.2 RFLP profiles of the CP gene from different CTV isolates
• 4.3.3 SSCP patterns of p25 of different CTV Isolates
• 4.4 DISCUSION
• CHAPTER 5 CHARACTERIZATION OF CTV ISOLATES BY BIOLOGICAL INDEXING
• 5.1 INTRODUCTION
• 5.2 MATERIAL AND METHODS
• 5.2.1 Virus isolates
• 5.2.2 Evaluation of tristeza symptomatology
• 5.2.3 Biological indexing
• 5.3 RESULTS
• 5.3.1 Conformation through DTBIA
• 5.3.2 Biological indexing
• 5.4 DISCUSION
• CHAPTER 6 PRELIMINARY IDENTIFICATION OF CITRUS VIROIDS IN PUNJAB, PAKISTAN
• 6.1 INTRODUCTION
• 6.2 MATERIAL AND METHODS
• 6.2.1 Collection of samples
• 6.2.2 Nucleic acid extraction
• 6.2.3 Nucleic acid amplification by RT-PCR
• 6.2.4 Evaluation of symptoms
• 6.2.5 Cloning and sequencing
• CHAPTER 7 MAIN CONCLUSION AND FUTUTRE RESEARCHES
• 7.1 MAJOR CONCLUSION
• 7.1.1 Collection of samples and conformation of CTV
• 7.2 GROUP COMPOSITION ANALYSIS
• 7.2.1 RFLP analysis
• 7.3 GENETIC SEQUENCE ANALYSIS
• 7.3.1 Sequence identify analysis
• 7.3.2 Phylogenetic analysis
• 7.3.3 Alignment of deduced amino acid sequences analysis
• 7.4 BIOLOGICAL INDEXING
• 7.5 THE INNOVATION OF THIS STUDY
• 7.6 THIS STUDY CONFIRMS
• 7.7 RECOMMENDED FURTHER RESEARCH
• REFERENCES
• 攻读期成果
• APPENDIX