丙型肝炎病毒对树鼩原代肝细胞感染性的研究

论文摘要

丙型肝炎病毒是导致慢性丙型肝炎,肝硬化、肝纤维化甚至肝细胞癌的主要病原体。根据世界卫生组织1999年统计,全球约有1.7-2.0亿人感染HCV,我国丙型肝炎病毒的感染率为3.2%,属HCV中高度感染区。除人和黑猩猩是丙型肝炎病毒的自然宿主,至今尚未发现其他自然动物对HCV易感。理想的HCV小动物模型缺乏,严重制约了丙型肝炎相关致病机制的研究,也导致了尚无可完全治愈的临床药物和有效预防的疫苗。2005年高效的HCV病毒细胞培养体系的建立,使得一次性得到背景一致、病毒滴度高的HCV病毒成为可能；其中Charles Rice所构建的J6/JFH1病毒株已经被证实对黑猩猩有较高的感染性。但由于黑猩猩购买、饲养成本较高,亟待发现、开发新的丙型肝炎小动物模型。树鼩是主要分布于我国云南地区,体型较小,繁殖较快的低等灵长类动物。已有研究提示,树鼩可被HCV患者的血清感染,但是由于HCV患者血清的来源不明、病毒滴度较低、树鼩个体背景复杂等原因,丙型肝炎病毒对树鼩的感染性未被最终证实。本研究以人工驯化、繁育的树鼩为实验对象,采用二步灌流、胶原酶消化法,分离、获得树晌原代肝细胞（PTH）,用含生长因子的特殊培养基,长期培养PTH。分离获得的PTH,经过2-3天的适应期,逐渐进入对数生长期,培养8-10天后,肝实质细胞开始出现衰老凋亡。培养12天后,肝实质细胞逐渐减少,混杂的纤维状细胞迅速生长。培养过程中的原代肝细胞,用MTT法检测细胞活力,绘制细胞生长曲线,并用倒置显微镜观察细胞形态。丙酮酸氧化酶法检测PTH培养上清中ALT变化水平,发现第2天后ALT水平明显下降,随后一直维持在低水平。较低的转氨酶水平等相关肝功代偿性指标,说明胶原酶消化及相关细胞处理过程对细胞造成的损伤较小。采用J6/JFH1-Huh7.5.1细胞病毒培养体系,培养获得了病毒载量为108IU/ml以上、病毒滴度为106ffu/ml以上的病毒,用于感染生长状态良好的PTH。荧光定量PCR检测培养上清中HCV病毒载量最高可达4×105IU/ml。利用逆转录巢式PCR法,可间歇性检测到培养上清中HCV RNA。利用间接免疫荧光法检测PTH内HCV蛋白的表达,可以观察到HCV感染的PTH发出特异性绿色荧光,证实HCV抗原可在感染细胞中表达。PTH产生的二代HCV感染Huh7.5.1细胞,可在培养上清中检测到较低水平的HCV RNA,说明被HCV感染的PTH所产生的HCV病毒具有感染性。PTH所产生的感染性HCV,可以在PTH中进行病毒传代,第二代病毒与第一代病毒载量水平相当。培养上清中HCV RNA经核酸序列测定,发现5’NCR-C区段、E1-E2区段与J6/JFH1嵌合病毒中的J6对应基因区段高度同源,NS5B区段与嵌合病毒J6/JFH1中JFH1对应基因区段同源,但该区段存在细胞适应性突变I2750M。综上所述,本研究以人工驯化、繁育的树鼩为实验对象,利用二步灌流、胶原酶消化法,获得了生长状态良好的树鼩原代肝细胞,可以满足后续感染实验的要求。病毒核酸定量和定性检测,以及蛋白质水平检测均表明,树鼩原代肝细胞可被J6/JFH1病毒感染,并支持HCV病毒的培养传代,病毒增殖过程中存在HCV基因突变。这些实验结果为树鼩做丙型肝炎病毒小型动物模型,提供了实验依据,并且有助于研究HCV感染与复制的机制。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 插图与附表清单
• 英文缩写表
• 第一章 绪论
• 1.1 丙型肝炎病毒与丙型肝炎
• 1.1.1 HCV生物学特性
• 1.1.2 HCV基因的变异与分型
• 1.1.3 HCV的流行与传播
• 1.1.4 丙型肝炎的预防和治疗
• 1.1.5 HCV检测方法
• 1.2 HCV细胞培养体系
• 1.2.1 HCV感染细胞培养体系
• 1.2.2 HCV亚基因组转染细胞培养体系
• 1.2.3 HCV细胞适应性突变
• 1.2.4 HCV全基因组转染细胞培养体系
• 1.3 HCV动物模型
• 1.3.1 HCV动物模型研究现状
• 1.3.2 树鼩
• 1.3.3 HCV感染树鼩原代肝细胞模型
• 1.4 本研究的目的与意义
• 1.5 实验技术路线图
• 第二章 幼年树鼩原代肝细胞生长状况评价
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验动物
• 2.2.2 实验试剂（试剂盒）
• 2.2.3 实验仪器
• 2.2.4 实验方法
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 幼年树鼩原代肝细胞产量、活力及纯度
• 2.3.2 幼年树鼩与成年树鼩胞原代肝细胞比较
• 2.3.3 幼年树鼩原代肝细胞生长曲线
• 2.3.4 幼年树鼩原代肝细胞形态观察
• 2.3.5 幼年树鼩原代肝细胞培养上清中ALT水平
• 2.4 讨论
• 2.4.1 幼年树鼩原代肝细胞的分离获得
• 2.4.2 幼年树鼩与成年树鼩原代肝细胞的差异
• 2.4.3 幼年树鼩原代肝细胞生长曲线与形态观察
• 2.4.4 幼年树鼩原代肝细胞损伤
• 2.5 本章小结
• 第三章 J6/JFH1对树鼩原代肝细胞的感染性研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验试剂（试剂盒）
• 3.2.3 实验仪器
• 3.2.4 PCR引物
• 3.2.5 实验方法
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 J6/JFH1感染成年树鼩原代肝细胞定量PCR结果
• 3.3.2 J6/JFH1感染幼年树鼩原代肝细胞定量PCR结果
• 3.3.3 逆转录巢氏PCR检测培养上清液结果
• 3.3.4 间接免疫荧光检测Huh7.5.1和PTH中HCV蛋白表达
• 3.4 讨论
• 3.4.1 J6/JFH1感染树鼩原代肝细胞定量结果分析
• 3.4.2 J6/JFH1感染树鼩原代肝细胞定性结果分析
• 3.4.3 Huh7.5.1和PTH中HCV蛋白表达
• 3.4.4 J6/JFH1对幼年PTH和成年PTH的感染性分析
• 3.5 本章小结
• 第四章 J6/JFH1对树鼩原代肝细胞感染性的确定与突变分析
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验试剂（试剂盒）
• 4.2.3 实验仪器
• 4.2.4 实验方法
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 幼年PTH起源的HCV感染Huh7.5.1定量PCR结果
• 4.3.2 幼年PTH起源的HCV感染PTH定量PCR结果
• 4.3.3 成年PTH培养上清中HCV突变分析
• 4.4 讨论
• 4.4.1 幼年PTH起源的HCV对Huh7.5.1感染性分析
• 4.4.2 幼年PTH起源的HCV对PTH感染性分析
• 4.4.3 HCV突变分析
• 4.5 本章小结
• 第五章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录A 攻读硕士期间发表论文目录