丹参脂溶性提取物抗炎作用及机理研究

论文摘要

目的：研究丹参脂溶性提取物（SMLE）对细菌脂多糖（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞一氧化氮（NO）生成及相关炎症细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的影响,并探讨其可能的机制。在内毒素、脓毒血症休克及耳肿胀动物模型中考察药物体内抗炎作用。方法：建立LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应模型。采用Griess试剂法测定SMLE对NO释放量的影响；采用酶联免疫法（ELISA）测定SMLE对IL-1β、IL-6和]TNF-α水平的影响；应用实时定量PCR （real-time PCR）方法分析iNOS、IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达改变；采用免疫蛋白印记（Western blotting）法测定iNOS蛋白表达变化及IκB-α蛋白的降解和p65的核转位；采用流式细胞术测定细胞内ROS含量变化,荧光法测定细胞内GSH含量变化;采用流式细胞术测定细胞膜CD14和TLR4表达的变化;采用LPS导致内毒素休克和盲肠结扎穿孔术（CLP）导致脓毒血症休克模型考察药物对动物生存率的影响；采用PMA导致的耳肿胀模型考察SMLE对耳肿胀的抗炎作用。结果：SMLE抑制LPS刺激的RAW 264.7细胞NO的生成,并成剂量依赖性和时间依赖性关系。SMLE轻微抑制iNOS活性。SMLE剂量依赖性抑制细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的生成。SMLE剂量依赖性下调LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS、IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA水平和iNOS蛋白表达。SMLE抑制LPS诱导的IκB-α降解、p65核转位。SMLE抑制LPS诱导的细胞内ROS的生成及GSH的降低。SMLE抑制LPS诱导的胞膜CD14蛋白表达。SMLE对致死的LPS导致内毒素休克和CLP导致脓毒血症休克动物有明显的保护作用,提高了生存率。外涂SMLE可明显抑制PMA引起的耳肿胀,而口服给药无效。结论：SMLE通过抑制LPS诱导的IκB-α降解和p65核转位而抑制了NF-κB的激活,进一步抑制iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6基因和蛋白表达。而对NF-κB激活抑制是通过抑制胞内ROS的产生和胞膜CD14的表达来实现的。SMLE体内的抗炎作用为传统中药丹参在炎症疾病中的应用提供了依据。

论文目录

• 英文缩写词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 1 炎症发生机理与信号通路研究
• 2. 天然药物治疗炎症的研究现状
• 3. 丹参的研究现状及本研究的意义
• 参考文献
• 第一部分:SMLE的提取工艺与质控的研究
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 实验仪器
• 1.1.2 药物与实验试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 乙醇浓度对丹参浸出物体外抗炎效力的影响
• 1.2.2 丹参抗炎主要部位的确认
• 1.2.3 SMLE的提取
• 1.2.4 SMLE总酮含量测定
• 1.2.5 SMLE中丹参酮ⅡA,隐丹参酮,丹参酮Ⅰ,二氢丹参酮Ⅰ含量测定
• 1.3 结果
• 1.3.1 乙醇浓度对丹参浸出物体外抗炎效力的影响
• 1.3.2 丹参抗炎主要部位的确认
• 1.3.3 SMLE的提取
• 1.3.4 SMLE总酮含量测定
• 1.3.5 SMLE中丹参酮ⅡA,隐丹参酮,丹参酮Ⅰ,二氢丹参酮Ⅰ含量
• 1.4 讨论
• 第二部分 SMLE对体外NO产生的影响
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验仪器
• 2.1.2 实验试剂及配制
• 2.1.3 细胞株
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 SMLE对RAW264.7细胞24 h细胞毒作用
• 2标准曲线的绘制'>2.2.2 NaNO₂标准曲线的绘制
• 2.2.3 SMLE和混合物对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO的剂量依赖作用
• 2.2.4 SMLE对LPS诱导的RAW 264.7细胞释放NO的时间依赖作用
• 2.2.5 SMLE对硝普钠释放NO自由基的影响
• 2.2.6 SMLE对LPS诱导的iNOS活性的影响
• 2.2.7 统计学分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 SMLE对RAW264.7细胞24 h细胞毒作用
• 2标准曲线的绘制'>2.3.2 NaNO₂标准曲线的绘制
• 2.3.3 SMLE和混合物对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO的剂量依赖作用
• 2.3.4 SMLE对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO的时间依赖作用
• 2.3.5 SMLE硝普钠释放NO自由基的影响
• 2.3.6 SMLE对iNOS活性影响
• 2.4 讨论
• 参考文献
• 第三部分 SMLE对LPS诱导的RAW264.7细胞产生细胞因子的影响
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验仪器
• 3.1.2 实验试剂
• 3.1.3 细胞株
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 IL-1β、IL-6、TNF-α的检测
• 3.2.2 统计学分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 IL-1β、IL-6、TNF-α标准曲线的制作
• 3.3.2 SMLE对细胞分泌IL-1β、IL-6、TNF-α的影响
• 3.4 讨论
• 参考文献
• 第四部分 从核酸水平研究SMLE对iNOS及炎症因子基因表达的影响
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验仪器
• 4.1.2 实验试剂及耗材
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 细胞培养及药物作用
• 4.2.2 RNA的提取
• 4.2.3 RNA的反转录
• 4.2.4 实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）
• 4.2.5 统计学分析
• 4.3 结果与分析
• 4.4 讨论
• 第五部分 从胞内蛋白水平研究SMLE对iNOS表达及NF-κB通路的影响
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 仪器
• 5.1.2 实验试剂与耗材
• 5.1.3 实验溶液的配制
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 目的蛋白的选择
• 5.2.2 蛋白提取
• 5.2.3 蛋白浓度测定
• 5.2.4 免疫蛋白印迹分析（Western Blotting）
• 5.2.5 统计分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 SMLE对NOS蛋白表达的影响
• 5.3.2 SMLE对LPS诱导的RAW264.7细胞IκB-α降解和p65核转位的作用
• 5.4 讨论
• 参考文献
• 第六部分:SMLE对细胞内ROS水平和GSH水平的影响
• 6.1 SMLE对LPS刺激RAW 264.7细胞内ROS水平的影响
• 6.1.1 实验材料
• 6.1.2 实验方法
• 6.1.3 实验结果
• 6.2 SMLE对LPS刺激RAW 264.7细胞GSH水平的影响
• 6.2.1 实验材料
• 6.2.2 实验方法
• 6.2.3 实验结果
• 6.2.4 讨论
• 参考文献
• 第七部分 SMLE对细胞膜表面CD-14、TLR-4蛋白表达水平的影响
• 7.1 实验材料
• 7.1.1 实验仪器
• 7.1.2 实验试剂与耗材
• 7.2 实验方法
• 7.3 实验结果
• 7.3.1 SMLE对LPS诱导后CD14表达的影响
• 7.3.2 SMLE对LPS受体TLR4/MD-2复合物表达的影响
• 7.4 讨论
• 参考文献
• 第八部分 SMLE对动物全身与局部炎症模型的影响
• 8.1 SMLE对LPS导致动物内毒素血症的死亡保护作用
• 8.1.1 实验材料
• 8.1.2 实验方法
• 8.1.3 实验结果
• 8.2 SMLE对动物盲肠结扎导致脓毒血症的死亡保护作用
• 8.2.1 实验材料
• 8.2.2 实验方法
• 8.2.3 实验结果
• 8.3 不同给药途径SMLE对耳肿胀动物的抗炎作用
• 8.3.1 实验材料
• 8.3.2 实验方法
• 8.3.3 实验结果
• 8.3.4 讨论
• 参考文献
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 致谢
• 公开发表的学术论文、专著及参加的科研项目
• 参加的科研项目