新基因Mipu1的表达模式及抗心肌细胞凋亡作用研究

论文摘要

心肌缺血在临床上非常常见,如冠状动脉粥样硬化引起的冠脉阻塞,冠状动脉痉挛、体外循环下行开心直视手术引起的心肌缺血,以及心脏移植供体心的缺血等。短暂的心肌缺血.再灌注可以诱导许多具有细胞保护作用的基因表达上调,这些表达上调的基因是心肌内源性保护分子机制的重要组成部分。多种基因的表达已被证实在心肌缺血-再灌注时发生改变,并发挥保护作用。如抗氧化酶基因超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱苷肽过氧化物酶（GSHPx-1）等在心肌缺血-再灌注后表达上调,可发挥清除活性氧,保护心肌免受氧化损伤的作用;热休克蛋白家族成员HSP70、HSP27、αB晶状体蛋白、HSP32等表达上调,可发挥修复受损蛋白、防止蛋白质聚集、降解变性蛋白及抗氧化等功能,增强心肌对损伤的抵抗力;缺血预适应可提高抗凋亡蛋白bcl-2的表达,而减少促凋亡蛋白Bax的表达,从而减轻心肌缺血.再灌注后的细胞凋亡发生率;而生长因子,特别是血管内皮生长因子（VEGF）的表达增加,有助于缺血心肌组织中微血管的新生及侧枝循环的建立,以改善缺血心肌的血液供应;其他如一氧化氮合酶、环氧合酶-2、脂肪酸结合蛋白、血管活性肠肽、醛糖还原酶等,都可以在心肌缺血-再灌注后表达发生改变,并发挥保护作用。本实验室袁灿博士采用生物信息学方法和5′RACE技术相结合,克隆了一个大鼠心肌短暂缺血一再灌注诱导表达上调的新基因Mipul（GenBank登录号AY221750）,该基因定位于大鼠染色体1q12.1,其全长由五个外显子和四个内含子组成。Mipu1 mRNA在心、脑表达较高,在其他组织表达较少,Mipu1的开放阅读框由1824个核苷酸组成,编码含608个氨基酸的多肽链。Mipu1是一个典型的C2H2型锌指蛋白,N-末端有一个KRAB结构域,C-末端有14个C2H2锌指基序。蒋磊等利用随机寡核苷酸文库筛选到了一个Mipu1共同的DNA结合序列5’-TGTCTTATCGAA-3’,证明该序列是Mipu1的特异性DNA结合位点,其中CTTA为结合位点的核心序列,发现Mipu1蛋白的C-末端的六个锌指为其与DNA结合所足够与必需,并证明Mipu1是一个转录抑制因子。为了观察Mipu1表达模式和可能的心肌保护功能,本研究首先纯化了大鼠Mipu1原核表达蛋白,制备了兔抗鼠Mipu1多克隆抗体,发现Mipu1蛋白定位于细胞核,Mipu1蛋白在脑及心肌组织中表达最高,肝、睾丸、肾、骨骼肌、卵巢次之,脾、肺中未检测到。采用Northern blot、RT-PCR和Western blotting分别于mRNA和蛋白质水平检测了Mipu1在短暂缺血再灌注心肌组织及H2O2刺激心肌细胞中的表达模式,发现Mipu1在缺血-再灌注心肌组织表达增加,6h达到高峰,持续到12h;Mipu1在H2O2刺激的H9c2细胞中表达亦显著增加,并呈时间与剂量依赖模式。心肌缺血/再灌注损伤、心肌梗塞等心脏疾病引起心肌细胞凋亡和坏死,而活性氧在心肌细胞的损伤中发挥重要作用。本研究进一步观察了Mipu1对氧化应激所致心肌细胞损伤的可能保护作用,采用Mipu1基因转染增加H9c2细胞中Mipu1的表达及采用RNA干扰技术（RNAi）抑制H9c2细胞中Mipu1的表达,采用活性氧H2O2导致H9c2细胞损伤,采用流式细胞术观察细胞凋亡发生率,发现Mipu1过表达可显著减少H2O2所致的细胞凋亡,降低氧化应激状态下Caspase-3的活性,而Mipu1-RNAi则显著促进H2O2所致的细胞凋亡,并升高氧化应激状态下Caspase-3的活性。基于Mipu1是一核转录因子,因此我们推测Mipu1可能通过调控某些重要凋亡相关基因的表达而参与凋亡进程的调节。首先生物信息学技术对凋亡相关基因启动子区的序列进行了分析,发现多个凋亡相关基因的启动子区含有Mipu1的DNA结合位点的核心序列,从中选取了3个具有代表性的凋亡相关基因Bax、Fas、Bcl-2,观察了Mipu1对这3个基因表达的影响,并对其调控机制进行了探讨,获得了以下实验结果:（1）H9c2经H2O2刺激之后,Bax的表达升高,Mipu1过表达使Bax蛋白的基础表达和诱导表达均降低,采用RNAi抑制Mipu1表达使Bax蛋白的基础表达和诱导表达均升高;采用荧光素酶报告基因检测发现在正常状态及H2O2刺激下,Mipu1均能够抑制Bax基因启动子的转录活性,Mipu1-RNAi则能促进Bax基因启动子的转录活性;采用染色质免疫沉淀（ChIP）发现在正常状态及H2O2刺激下,Mipu1能与Bax基因的启动子区结合,H2O2能增强其结合活性。（2）H9c2经H2O2刺激之后,Fas的表达升高,Mipu1过表达使Fas蛋白的基础表达和诱导表达均降低,Mipu1-RNAi则使Fas蛋白的基础表达和诱导表达均升高;采用荧光素酶报告基因检测发现在正常状态及H2O2刺激下,Mipu1均能够抑制Fas基因启动子的转录活性,Mipu1-RNAi则能促进Fas基因启动子的转录活性;采用ChIP发现在正常状态及H2O2刺激下,Mipu1能与Fas的启动子区结合,H2O2能增强其结合活性。（3）H9c2经H2O2刺激之后,Bcl-2的表达升高,Mipu1过表达使Bcl-2蛋白的基础表达和诱导表达均升高,Mipu1-RNAi则使Bcl-2蛋白的基础表达和诱导表达均降低;采用荧光素酶报告基因检测发现在正常状态及H2O2刺激下,Mipu1能够促进Bcl-2基因启动子的转录活性,Mipu1-RNAi能够抑制Bcl-2基因启动子的转录活性;ChIP发现在正常状态及H2O2刺激下,Mipu1不能与Bcl-2的启动子区结合。综上所述,Mipu1蛋白定位于胞核,在脑和心脏组织表达较高,在肝、睾丸、肾、骨骼肌组织中有弱表达,在肺和脾组织中无表达;Mipu1在缺血-再灌注大鼠心肌组织及H2O2刺激的H9c2心肌细胞表达明显升高;Mipu1能抑制过氧化氢所致的H9c2心肌细胞凋亡,其机制与其通过抑制促凋亡相关基因Fas、Bax的表达,并促进凋亡抗相关基因Bcl-2的表达有关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 技术路线
• 第一章 Mipu1蛋白纯化、抗体制备、表达和亚细胞分布
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.1.1 主要材料与试剂
• 1.1.1.2 主要仪器
• 1.1.2 方法
• 1.1.2.1 His-tagged Mipu1的粗提与纯化
• 1.1.2.2 蛋白质的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.1.2.3 质谱分析
• 1.1.2.4 数据库查询
• 1.1.2.5 兔抗鼠Mipu1抗血清制备
• 1.1.2.6 间接ELISA法测定抗体滴度
• 1.1.2.7 抗体纯化
• 1.1.2.8 免疫荧光细胞化学技术观察Mipu1在细胞内的分布
• 1.1.2.9 Western blotting
• 1.1.2.10 统计学处理
• 1.2 结果
• 1.2.1 Mipu1蛋白的表达、纯化及其验证
• 1.2.2 纯化蛋白Mipu1蛋白质谱分析
• 1.2.3 抗体监测
• 1.2.4 抗体滴度测定
• 1.2.5 多克隆抗体纯化及验证
• 1.2.6 Mipu1在H9c2细胞内定位
• 1.2.7 Mipu1在大鼠各组织中的表达
• 1.3 讨论
• 1.4 结论
• 第二章 缺血-再灌注及氧化应激对心肌中Mipu1表达的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 主要材料与试剂
• 2.1.1.2 引物及寡核苷酸序列
• 2.1.1.3 主要仪器
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 大鼠心肌短暂缺血-再灌注损伤动物模型的建立
• 2.1.2.2 细胞培养及过氧化氢（H2O2）处理
• 2.1.2.3 组织及细胞总RNA的提取及逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）
• 2.1.2.4 荧光定量PCR（Real-time PCR）
• 2.1.1.5 Northern blot
• 2.1.2.6 原位杂交
• 2.1.2.7 免疫组织化学
• 2.1.2.8 统计学处理
• 2.2 结果
• 2.2.1 大鼠心肌缺血-再灌注损伤动物模型的建立
• 2.2.2 大鼠缺血-再灌注损伤心肌中Mipu1 mRNA的动态变化
• 2.2.3 大鼠缺血-再灌注损伤心肌中Mipu1蛋白表达水平的动态变化
• 2.2.4 氧化应激损伤对H9c2细胞中Mipu1表达的影响
• 2.2.5 原位杂交显示Mipu1 mRNA在大鼠缺血心肌中的表达
• 2.3 分析与讨论
• 2.4 结论
• 第三章 Mipu1对氧化应激所致H9c2心肌细胞凋亡的影响
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 主要材料和试剂
• 3.1.1.2 主要仪器
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 细胞培养
• 3.1.2.2 过氧化氢（H2O2）处理
• 3.1.2.3 凋亡形态学观察及凋亡百分率计算
• 3.1.2.4 Mipu1-RNAi载体构建
• 3.1.2.5 脂质体转染
• 3.1.2.6 流式细胞术
• 3.1.2.7 Caspase-3活性定量检测
• 3.1.2.8 统计学处理
• 3.2 结果
• 3.2.1 Mipu1瞬时转染H9c2细胞中Mipu1蛋白的表达
• 3.2.2 Mipu1过表达对H2O2所致H9c2心肌细胞凋亡的影响
• 3.2.3 Mipu1过表达对H2O2所致H9c2心肌细胞Caspase-3活化的影响
• 3.2.4 Mipu1干扰载体的构建
• 3.2.5 Mipu1-RNAi对H9c2细胞内源性Mipu1 mRNA表达的影响
• 3.2.6 Mipu1-RNAi对H9c2细胞内源性Mipu1蛋白表达的影响
• 2O₂所致H9c2心肌细胞凋亡的影响'>3.2.7 Mipu1-RNAi对H₂O₂所致H9c2心肌细胞凋亡的影响
• 2O₂所致H9c2心肌细胞Caspase-3的活化的影响'>3.2.8 Mipu1-RNAi对H₂O₂所致H9c2心肌细胞Caspase-3的活化的影响
• 3.3 分析与讨论
• 3.4 结论
• 第四章 Mipu1对凋亡相关基因Bax,Fas,Bcl-2表达的影响及其机制
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 主要材料和试剂
• 4.1.1.2 主要仪器
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 生物信息学分析
• 4.1.2.2 基因组DNA的提取
• 4.1.2.3 报告基因系统的构建
• 4.1.2.4 荧光素酶活性的测定
• 4.1.2.5 染色质免疫共沉淀实验（ChIP）
• 4.1.2.6.统计学处理
• 4.2 结果
• 4.2.1 Mipu1过表达对凋亡相关基因Bax表达的影响
• 4.2.2 Mipu1-RNAi对凋亡相关基因Bax表达的影响
• 4.2.3 染色质免疫共沉淀实验显示Mipu1蛋白能与Bax启动子结合
• 4.2.4 Mipu1过表达对凋亡相关基因Fas表达的影响
• 4.2.5 Mipu1-RNAi对凋亡相关基因Fas表达的影响
• 4.2.6 染色质免疫共沉淀实验显示Mipu1蛋白能与Fas启动子结合
• 4.2.7 Mipu1过表达对凋亡相关基因Bcl-2表达的影响
• 4.2.8 Mipu1-RNAi对凋亡相关基因Bcl-2表达的影响
• 4.2.9 ChIP实验结果显示Mipu1不能与Bcl-2启动子结合
• 4.3 分析与讨论
• 4.4 结论
• 总结论
• 参考文献
• 综述Ⅰ
• 参考文献
• 综述Ⅱ
• 参考文献
• 攻读学位期间主要的研究成果目录
• 致谢