论文摘要
盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）是一种社会变形虫,在营养丰富的条件下,以二分裂方式繁殖生长;当食物耗尽时,开始多细胞发育。盘基网柄菌的多细胞发育过程尽管相对简单,但涉及到一系列信号分子的调控与高等生物十分相似,在高等生物发育过程中能找到这些信号蛋白的同源体。因此在生命科学研究领域中,盘基网柄菌经常被用作模式生物来研究多细胞发育、细胞凋亡等过程中的信号分子调控。LagC基因编码的gp150蛋白是一种膜蛋白,在细胞与细胞接触区域特别丰富,它通过异嗜性相互作用来调节细胞间的紧密黏着。gp150蛋白是在盘基网柄菌发育聚集期开始后才开始表达,当盘基网柄菌发育到12小时的时候,用Western blot可以在野生型KAx-3细胞中检测出明显的gp150蛋白条带;而在突变型AK127细胞中,完全检测不到gp150蛋白的表达。gp150缺失的细胞株AK127不能完成多细胞发育,发育只能停留在细胞松散聚集阶段。由此推测,gp150蛋白在盘基网柄菌发育过程中起着重要作用,它可能参与介导细胞分化和凋亡的信号转导途径,但具体的信号通路至今仍未完全清楚。因此,本研究以发育到14小时的盘基网柄菌细胞为实验材料,试图从寻找野生型细胞株KAX-3和突变型细胞株AK127差异表达的基因入手,进一步摸清由gp150介导的信号通路及其相关的调控途径。本研究通过提取盘基网柄菌发育14小时的野生型KAx-3细胞和突变型AK127细胞的总RNA,运用mRNA差异显示法分离出了两条明显的差异表达片段,其中片段A来自野生型KAX-3细胞,片段C来自突变型Ak127细胞;并通过凝胶回收差异片段、对差异片段进行再次PCR、蓝白斑筛选克隆、提取质粒、酶切电泳纯化差异片段;接着进行Northern杂交的结果表明,片段A只与野生型KAx-3细胞的总RNA有杂交信号,片段C只与突变型AK127细胞的总RNA有杂交信号,这就排除了差异片段假阳性的可能;最后通过测序,搜索NCBI BLAST数据库发现:片段A的小部分序列与编码组氨酸激酶DhkA基因中一段序列的相似性高达91%,与编码组氨酸激酶DhkF基因中的一段序列相似性高达92%,与编码STATc蛋白基因的一段序列相似性达91%,以及与编码同源框蛋白的基因中的一段序列相似性达97%,这些基因在盘基网柄菌细胞分化和细胞比例调控过程中起着相当重要的作用,这些数据进一步说明了突变细胞不能完成发育的原因。片段C与盘基网柄菌线粒体DNA中的一段635bp的序列的相似度达99%,这一段序列包含了基因nad3的大部分序列、编码tRNA-Cys和tRNA-Asn的全部基因序列。nad3的编码产物是NADH脱氢酶亚基3,NADH是细胞能量代谢所必需的辅酶,在生物过程中起电子传递作用,是呼吸链中传递氢过程中的一环,在多数情况下代谢物上脱下的氢先交给NAD+,使之成为NADH和H+,然后在NADH脱氢酶的作用下,把氢交给黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）或黄素单核苷酸（FMN）,再通过呼吸链的传递,最后交给氧,并释放能量,细胞内NAD+/NADH比率不仅对细胞内的氧化还原状态具有重要的调节作用,而且常被作为活体内的代谢指标,与细胞的代谢、节律、衰老、病变、死亡等重大生命过程有着及其紧密的联系。NADH脱氢酶催化由NADH转变为NAD+的过程,对NAD+/NADH比率起调节作用,因此也是调节细胞代谢、凋亡过程的重要物质。gp150蛋白调控的信号途径可能包含了上述基因,这些基因在盘基网柄菌细胞分化和细胞比例调控过程中起着重要的作用,gp150蛋白可能正是通过影响这些基因的表达来对盘基网柄菌的发育过程进行调控。本论文的研究为进一步证明这些基因在盘基网柄菌KAx-3细胞和AK127细胞中差异表达,构建载体表达这些基因,制备抗体,追踪相关分子在机体中的定位及相关功能的研究奠定了基础。