马动脉炎病毒结构蛋白基因的克隆、表达、实验免疫与相关诊断技术的建立

论文题目: 马动脉炎病毒结构蛋白基因的克隆、表达、实验免疫与相关诊断技术的建立

论文类型: 博士论文

论文专业: 预防兽医学

作者: 杜建

导师: 张念祖,金宁一

关键词: 马动脉炎病毒,大囊膜糖蛋白,膜蛋白,核蛋白,汉逊酵母,串联表位,核酸疫苗,荧光定量

文献来源: 吉林大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本论文运用现代生物学技术和手段进行了马动脉炎病毒主要结构蛋白基因的克隆、序列分析、原核表达,并在原核表达的基础上初步建立了ELISA 诊断方法;利用新型汉逊酵母表达系统对此病毒的主要结构蛋白基因及其串联表位进行了表达研究;利用真核表达载体构建核酸疫苗并进行了实验免疫研究;同时建立了病毒荧光定量PCR 的诊断技术,全文内容概述如下:1 采用RT-PCR 方法扩增马动脉炎病毒主要免疫原性的结构蛋白GP5、M、N,将它们分别克隆至载体pUC18 和pMD18-T 中,运用DNAstar 等软件对克隆的基因进行了分析,随后将GP5、M、N 三个基因和M 截短基因分别克隆至原核表达载体pGEX-6P-1 和pET32a 中,在E.coli 中进行了诱导表达,结果显示:GP5、M 基因在上述两种原核表达载体中均未检测到表达,M 截短基因(Mt)在pGEX-6P-1 中得到高效表达,而N 基因在两种原核表达载体中均高效表达,表达产物的Western Blot实验证实目的蛋白有生物学活性,有望做为诊断抗原。2 将GP5、M、N 全基因构建到新型汉逊酵母分泌型表达载体pHFMDHZ-α-A中,经电转筛选到含GP5、M、N 全基因的多拷贝重组汉逊酵母,0.5%甲醇诱导,SDS-PAGE 和Western Blot 分析,未检测到目的蛋白的表达。依据GP5、M 和N基因的核苷酸序列翻译的蛋白氨基酸的序列,按汉逊酵母密码子的偏好优化EAVGP5、M 和N 基因密码子,采用人工合成GP5、M 和N 基因的主要抗原表位,通过柔性序列将GP5、M 和N 的表位串联起来,构建了pHFMDHZ-α-GP5-M-N,转化汉逊酵母后成功获得重组菌,诱导表达获得了有生物学活性的目的蛋白,为EAV 新型诊断试剂和亚单位疫苗的生产创造了条件。3 借助真核表达载体pcDNA3 和pVAX1 构建了GP5、M 和N 基因的核酸疫苗,采用脂质体转染BHK-21 细胞的方法,经RT-PCR 检测到相应目的基因的转录,间接免疫荧光试验证明瞬时表达的蛋白能与EAV 抗体发生特异的抗原抗体反应。用单基因和多基因的不同免疫方式,在大鼠中试验了核酸疫苗的免疫效果,pcDNA3

论文目录:

前言

第一篇 文献综述

第一章 马病毒性动脉炎研究进展

第二章 汉逊酵母表达体系研究进展

第二篇 研究内容

第一章 马动脉炎病毒结构蛋白GP5、M、N 基因的克隆、序列分析及原核表达研究

1 材料和方法

2 结果

2.1 病毒产生的细胞病变结果

2.2 GP5、M 和N 基因的RT-PCR 扩增结果

2.3 重组质粒的pUC18-GP5、pUC18-M、pMD18-T-N PCR 和酶切鉴定

2.4 基因的序列测定及其分析

2.5 GP5、M、N和M截短Mt基因片段的扩增及重组表达载体的构建和鉴定

2.6 目的蛋白在大肠杆菌中的诱导表达和SDS-PAGE 分析

2.7 Western-blotting 检测结果

3 讨论

4 小结

第二章 马动脉炎病毒结构蛋白及其串联表位在汉逊酵母中的表达研究

1 材料和方法

2 结果

2.1 全基因目的片段的PCR 扩增

2.2 酵母重组全基因载体的PCR 及酶切鉴定

2.3 全基因重组酵母工程菌的PCR鉴定

2.4 汉逊重组酵母GP5-M-N 工程菌的诱导表达产物的SDS-PAGE 与Western blot

3 讨论

4 小结

第三章 马动脉炎病毒核酸疫苗表达载体的构建、表达与实验免疫研究

1 材料和方法

2 结果

2.1 重组表达载体的构建及鉴定

2.2 重组表达载体在BHK-21 细胞上的瞬时表达与检测

2.3 重组表达载体转录水平检测结果

2.4 基因疫苗免疫大鼠ELISA 抗体检测结果

2.5 基因疫苗免疫大鼠血清中和抗体检测结果

3 讨论

4 小结

第四章 马动脉炎病毒Real-Time PCR 检测方法的建立

1 材料和方法

2 结果

2.1 常规PCR 和TaqMan RT-PCR 的特异性分析

2.2 引物和探针浓度的筛选

2.3 TaqMan RT-PCR 的敏感性及标准曲线的建立

2.4 重复性和稳定性试验

3 讨论

4 小结

第五章 马动脉炎病毒核蛋白基因重组抗原间接ELISA检测方法的初步建立

1 材料和方法

2 结果

2.1 重组N蛋白的纯化效果

2.2 抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定

2.3 封闭液的选择

2.4 判定标准的确定

2.5 特异性试验

2.6 重复性试验

3 讨论

4 小结

结论

参考文献

附录

攻博期间发表的学术论文及其他成果

致谢

导师及作者简介

中文摘要

英文摘要

发布时间: 2005-08-26

参考文献

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