水稻瘤矮病毒P8和Pns10基因在sf9昆虫细胞中的表达

论文摘要

目的：利用bac-to-bac杆状病毒表达系统对RGDV-P8和RGDV-Pns10基因加以表达，得到RGDV-P8和RGDV-Pns10基因的真核表达产物，为RGDV-P8和RGDV-Pns10的功能研究奠定基础。方法：在RGDV-P8和RGDV-Pns10基因组片段的基础上设计引物，扩增得到RGDV-P8和RGDV-Pns10 ORF，将其克隆到供体质粒pFastBacTMHTb中，经PCR、酶切和测序鉴定后，将测序正确的质粒转化DH10Bac菌，经筛选、鉴定后，抽提并获取高纯度的重组穿梭载体Bacmid-RGDV-P8和Bacmid-RGDV-Pns10。用脂质体介导法将重组穿梭载体Bacmid-RGDV-P8和Bacmid-RGDV-Pns10转染Sf9昆虫细胞，获得重组病毒，并反复扩增后得到大量表达RGDV-P8和RGDV-Pns10蛋白的重组杆状病毒。用重组的杆状病毒再次感染sf9昆虫细胞得到RGDV-P8和RGDV-Pns10融合蛋白，对融合蛋白进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定。结果：1．构建了携带RGDV-P8和RGDV-Pns10基因片段的重组供体质粒pfastbacHTb-RGDV-P8和pfastbacHTb-RGDV-Pns10，经双酶切鉴定和序列分析证实RGDV-P8和RGDV-Pns10基因已正确插入供体质粒的多克隆位点。2．构建了携带RGDV-P8和RGDV-Pns10基因片段的重组穿梭载体Bacmid-RGDV-P8和Bacmid-RGDV-Pns10，经PCR鉴定分析证实RGDV-P8和RGDV-Pns10基因已正确转座插入穿梭载体的转座位点。3．用bac-to-bac系统表达了RGDV-P8和RGDV-Pns10融合蛋白，并经SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定，分子量约为48kD和38kD，与融合蛋白的理论分子量相符。结论：本研究成功地在杆状病毒-昆虫表达系统中表达了RGDV-P8和RGDV-Pns10蛋白，为RGDV-P8和RGDV-Pns10蛋白进一步的功能研究和实际应用奠定了良好的基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 RGDV分布和症状
• 1.2 传毒介体及传毒特性
• 1.3 水稻瘤矮病的发病规律与防治措施
• 1.3.1 水稻瘤矮病的发病规律
• 1.3.2 水稻瘤矮病的防治措施
• 1.4 基因组结构与功能
• 1.4.1 RGDV粒体形态与特性
• 1.4.2 基因组结构与功能
• 1.5 杆状病毒表达系统研究概况
• 1.5.1 昆虫杆状病毒表达系统的研究和应用进展
• 1.5.2 杆状病毒表达系统的原理及特点
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试病毒
• 2.1.2 试剂和酶类
• 2.1.3 载体和菌株
• 2.1.4 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 RGDV双链RNA的抽提与纯化及定量
• 2.2.1.1 RGDV-dsRNA的提取与纯化
• 2.2.1.2 dsRNA的定量
• 2.2.2 P8和PNS10基因的扩增
• 2.2.2.1 引物设计与合成
• 2.2.2.2 cDNA合成
• 2.2.2.3 PCR扩增
• 2.2.2.4 PCR产物纯化
• 2.2.3 DNA克隆技术
• 2.2.3.1 目的片段与pMD18-T Vector的连接反应
• 2法）'>2.2.3.2 大肠杆菌感受态细胞的简易制备（CaCl₂法）
• 2.2.3.3 连接反应物对宿主感受态细胞的转化
• 2.2.4 重组克隆的PCR筛选
• 2.2.5 质粒的少量提纯（碱法）
• 2.2.5.1 碱裂解法小量制备质粒DNA
• 2.2.5.2 P8和PNS10重组质粒的酶切鉴定
• 2.2.6 重组杆状病毒表达载体的构建
• 2.2.6.1 供体质粒的构建
• 2.2.6.2 序列测定
• 2.2.7 重组杆粒的获得与鉴定
• 2.2.7.1 DH10BAC感受态细胞的制备
• 2.2.7.2 转化
• 2.2.7.3 阳性重组子RGDV-P8-bacmid和RGDV-P10-bacmid杆粒的抽提
• 2.2.8 昆虫细胞的培养
• 2.2.8.1 Grace’s培养基的配制
• 2.2.8.2 细胞的复苏和传代
• 2.2.8.3 sf9细胞的冻存
• 2.2.8.4 血细胞计数板计数
• 2.2.8.5 sf9细胞的培养
• 2.2.9 重组BACMID DNA转染SF9细胞及重组病毒的收获
• 2.2.10 扩毒
• 2.2.11 重组病毒的PCR鉴定
• 2.2.12 目的蛋白的表达和表达产物的鉴定
• 2.2.12.1 感染
• 2.2.12.2 细胞收集
• 2.2.12.3 细胞裂解
• 2.2.12.4 蛋白的SDS-PAGE电泳
• 2.2.12.5 蛋白的western-blot鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 RGDV-DSRNA的提取及纯化
• 3.2 目的基因的克隆
• 3.2.1 基因组P8片段的PCR扩增及克隆
• 3.2.2 基因组PNS10片段的PCR扩增及克隆
• 3.3 重组转座载体的构建
• 3.4 重组转座载体的酶切分析
• 3.5 序列测定与分析
• 3.6 重组杆状病毒BAC-HTB的鉴定
• 3.7 转移载体杆粒制备
• 3.8 Sf9昆虫细胞生长曲线测定和培养
• 3.9 正常Sf9细胞形态和Bac-HTb转染后Sf9细胞的形态变化
• 3.10 重组蛋白的SDS-PAGE分析
• 3.11 重组蛋白的WESTERN-BLOT分析
• 4 讨论
• 4.1 杆状病毒表达系统
• 4.2 Sf9昆虫细胞的培养
• 4.3 HCV结构蛋白的表达
• 4.4 蛋白收获的时间
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢