肾小球系膜细胞内钙振荡的产生及其调节细胞收缩的机制研究

论文摘要

背景和目的：肾小球（glomerulus）阻力增加能够引起肾小球滤过率（GFR）降低和肾小球硬化的进展，部分原因是由于肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cells，GMCs）收缩导致的。众所周知GMCs的收缩由细胞内钙离子浓度的变化调节。目前随着新技术的发展（共聚焦显微镜技术），对胞内钙离子信号的研究从胞浆内总体钙浓度的变化研究过渡到微观细胞内钙波（calcium waves）、钙振荡（calcium oscillations）和钙火花（calcium sparks）的生物学效应的探讨。我们研究发现GMCs在外界刺激的情况下能够产生持续的细胞内钙振荡，但是GMCs内钙振荡在外界刺激下是如何产生的，是否钙振荡的产生及变化能够引起GMCs收缩，以及刺激物通过哪种钙振荡方式（频率方式、幅度方式）调节收缩，仍需要进一步探讨。方法：实验采用原代培养的3月龄，28月龄雄性Wistar大鼠（每组n=8）系膜细胞；种于35mm共聚焦专用培养皿（Glass Bottom Microwell Dishes）中，用钙离子荧光探针Fluo-3标记细胞，共聚焦显微镜60×油镜下观察不同浓度血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）刺激产生的GMCs胞内钙振荡的变化。同时分别加入不同钙离子阻断剂Thapsigangin（TG），EGTA，2-aminoethoxydiphenyl borate（2-APB），Ryanodine和1-0-octadecyl-2-0-methyl-sn-glycero-3-phospho-rylcholine（ET-18-OCH3）后，观察GMCs内钙离子振荡的变化，阐明其产生机制；通过检测肌球蛋白轻链(MLC20)磷酸化的水平和GMCs平面表面积收缩试验检测系膜细胞的收缩情况；通过细胞间接免疫荧光染色检测系膜细胞内InsP3受体和Ryanodine受体亚型的表达及其共定位的情况。结果：在单个GMCs中，AngⅡ能够诱导典型的钙离子振荡，这种钙振荡能够完全被TG，2-APB及ET-18-OCH，抑制，只能被ryanodine部分抑制，在细胞外钙缺乏的情况下不能被抑制。进而发现ryanodine受体和InsP3受体存在很强的共定位现象，起着放大Ca2+信号的作用。在排除了全细胞Ca2+水平变化的影响后，MLC20的磷酸化和GMCs的收缩与钙振荡有关。钙振荡的频率调节GMCs的收缩，这种作用能够被KN-93抑制，而衰老相关的收缩降低却与振荡的幅度降低相关。结论：我们的结果证明，单个系膜细胞对AngⅡ引起的钙离子反映是典型的钙离子振荡；钙振荡通过PLC-InsP3途径激活产生，通过后续激活的ryanodine受体释放钙离子放大钙振荡信号，最后内质网钙泵重吸收钙离子完成一个钙振荡周期；进而首次证明钙振荡是调节GMCs收缩所必须的，在不同浓度的AngⅡ刺激下，钙振荡通过频率依赖的模式（a frequency-dependent mode）调节GMCs收缩，而随细胞衰老，钙振荡幅度（a amplitude-dependent mode）降低导致GMCs收缩下降。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 实验研究一 肾小球系膜细胞内钙振荡产生机制的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 实验研究二 肾小球系膜细胞内钙振荡调节细胞收缩的机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 全文总结
• 文献综述 细胞内钙离子信号转导途径的研究进展——动态、稳态及相互转换调节
• 附录 英文缩略词表
• 攻读学位期间发表论文情况
• 致谢