丰香草莓高效再生的机理及遗传转化研究

论文题目: 丰香草莓高效再生的机理及遗传转化研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 果树学

作者: 秦永华

导师: 张上隆

关键词: 草莓,激素配比,有色膜,暗处理,抗菌肽基因,胰岛素基因,植物表达载体,离体再生体系,根癌农杆菌转化,抗生素,检测,杂交

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 草莓是重要的水果之一,在世界各地广泛分布。草莓栽培中存在不少问题,如耐寒、抗虫、抗病、抗病毒等优良品种缺乏,严重制约了草莓生产的发展。过去常规杂交育种在提高草莓品种的产量、品质等方面取得了一定进展,但草莓多为八倍体,遗传上高度杂合,给杂交育种带来很大困难,而且常规育种周期长,费时费力,给育种工作者带来了难度,因此需引进新的手段和方法进行育种。现代生物技术的飞速发展为草莓育种提供了新途径,它可以获得常规育种难以得到的新类型,从而创造出新种质。现代生物技术在植物育种中的应用是随植物组织培养技术的发展而兴起的。由于农杆菌介导的遗传转化主要依赖于受体材料的再生能力及农杆菌的转化效率,因此建立高效的受体再生体系是遗传转化成功的关键。本试验以草莓主栽品种丰香为试材,研究了再生过程中激素配比、有色膜、AgNO3、暗培养、抗生素等因素对草莓离体再生的影响,探讨了不同有色膜下丰香草莓再生差异的原因和AgNO3对草莓生长的影响及其机理,为建立高效、可重复的再生体系奠定理论基础。在分别构建ADP和INS基因植物表达载体基础上,通过根癌农杆菌介导分别将APD和INS基因导入草莓基因组,对影响农杆菌转化频率的各种主要因素进行筛选,得到一个最佳的转化体系,获得了转化植株。Kan筛选、PCR检测和Southern杂交检测证明目的ADP基因已经整合到草莓基因组中。对INS基因抗性愈伤组织PCR检测表明,INS基因已整合到草莓基因组中。主要研究结果如下: （一） 草莓高效离体再生体系的建立 （1） 不同激素组合对丰香草莓不定芽再生能力的研究表明:TDZ单独使用可以诱导出不定芽,随着TDZ浓度的增加,不定芽再生率逐渐提高,但诱导出的不定芽玻璃化现象也随之加剧。因此,TDZ不宜过高,以1.5mg.L-1为宜。TDZ 1.5mg.L-1与IBA配合使用,可显著提高丰香不定芽的再生率,当IBA的浓度为0.4mg.L-1时不定芽再生率最高（76.7%）。2,4-D不利于芽的分化,随着2,4-D浓度的提高,不定芽再生率逐渐降低,诱导出的愈伤组织由浅黄色逐渐变为灰白色,并且褐化加剧。 （2） 重金属元素Ag+对丰香草莓不定芽再生能力的影响表明:草莓外植体在MS+1.5mg.L-1TDZ+0.4mg.L-1IBA分化培养基附加1.0mg.L-1AgNO3的中预培养10 d后转入不含Ag+的分化培养基中培养,不定芽再生率（87.38%）和每个外植体再生的芽数（11.67）有显著提高,且始分化期可以提前5-7 d。 （3） 不同有色膜对丰香不定芽再生的影响很大,培养45 d后,不同有色膜条件下不定芽再生率以红膜和绿膜为最好,分别为100%和98.28%,其次为荧光（75.81%）、蓝膜

论文目录:

缩略语表

中文摘要

第一章 文献综述

1 组织培养研究进展

1．1 茎尖培养

1．1．1 分离无病毒植株

1．1．2 快速繁殖

1．1．3 辐射诱变进行品种改良

1．2 叶片、叶柄和匍匐茎等器官的培养

1．3 花药培养

1．3．1 单倍体育种

1．3．2 获得脱毒苗

1．4 离体胚培养

1．5 原生质体培养及融合

1．6 细胞悬浮培养

2 影响外植体器官发生的因子及生理研究

2．1 活性氧与外植体器官发生

2．2 抗氧化酶与外植体器官发生

3 组培环境对组培苗生长的影响

3．1 物理因子

3．1．1 光

3．1．2 温度

3．1．3 湿度

3．1．4 气体的影响

3．2 化学因子

3．2．1 碳源

3．2．2 离子

3．3．3 培养基的pH值

3．3．4 支持材料

4 突变体筛选

5 种质资源保存

6 遗传转化

6．1 GUS，NOS和NPT Ⅱ基因的转化

6．2 抗虫基因的转化

6．3 抗病毒基因的转化

6．4 抗逆基因的转化

6．5 抗除草剂基因工程

6．6 品质改良的基因工程

第二章 草莓叶片高效再生体系的建立

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

1．2．1 培养基

1．2．2 不同有色膜处理及其光谱辐射能的测定

1．2．3 暗处理

1．2．4 培养条件

1．3 数据统计

2 结果与分析

2．1 不同激素组合对丰香不定芽分化的影响

2．2 AgNO_3对草莓不定芽分化的影响

2．3 不同有色膜物理特性及对丰香不定芽形成的影响

2．4 暗处理对丰香不定芽形成的影响

2．5 生根和驯化移栽

3 讨论

第三章 不同有色膜下丰香草莓的再生机理

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 培养基及培养条件

1．2．1 培养基

1．2 酶活性和丙二醛(MDA)含量的测定

1．3 激素含量测定

2 结果与分析

2．1 外植体在不同有色膜下的生理效应

2．1．1 叶绿素含量的变化

2．1．2 抗氧化酶活性的变化

2．1．3 MDA含量的变化

2．1．4 激素含量的变化

3 讨论

第四章 AgNO_3对草莓外植体生长及抗氧化酶活性的影响

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

1．2．2．1 酶的提取及测定

1．2．2．2 叶绿素色素含量

1．2．2．3 根系的活力

1．2．2．4 IAA含量

1．2．2．5 IAA氧化酶活性测定

1．2．2．6 脯氨酸含量的测定

1．2．2．7 乙烯释放量的测定

2 结果与分析

2．1 AgNO_3对草莓根生长的影响

2．2 AgNO_3对再生草莓植株生长的影响

2．3 AgNO_3对草莓叶片抗氧化酶的活性，O_2~(·-)生成速率及MDA含量的影响

2．4 AgNO_3对草莓叶片脯氨酸含量，乙烯释放量，IAA含量及其氧化酶活性的影响

3 讨论

第五章 抗生素对草莓外植体生长的影响

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 试剂

1．3 试验设计

2 结果与分析

2．1 Kan对组织培养形态发生的影响

2．2 Cef对组织培养形态发生的影响

2．3 Carb对组织培养形态发生的影响

2．4 Cef和Carb对组织培养形态发生的影响

3 讨论

第六章 抗菌肽D和Insulin基因植物表达载体的构建

1 材料和方法

1．1 菌株和质粒

1．2 酶及生化药剂

1．3 培养基

1．4 质粒DNA的小量提取

1．5 PCR

1．4 植物重组表达载体pBI12-APD和pBI121-INS的构建

1．4．1 pBI121-APD载体的构建

1．4．2 pBI121-INS载体的构建步骤

1．5 重组质粒的鉴定

1．6 目的基因的序列测定

2 结果与分析

2．1 pBI121-APD和pBI121-INS基因植物表达载体的构建策略

2．2 pBI121-APD和pBI121-INS基因植物表达载体的酶切鉴定

2．2．1 pBI121-APD基因植物表达载体的酶切鉴定

2．2．2 pBI121-INS基因植物表达载体的酶切鉴定

2．3 目的基因的序列测定

3 讨论

第七章 根癌农杆菌介导法转化草莓及转基因植株的鉴定

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 植物材料

1．1．2 菌株和质粒

1．1．3 化学试剂药品

1．1．4 培养基

1．1．5 引物合成

1．1．5．1 检测抗菌肽APD基因的引物设计

1．1．5．2 检测NPTⅡ基因的引物设计

1．1．5．3 检测胰岛素INS基因的引物设计

1．2 方法

1．2．1 农杆菌的培养

1．2．2 受体材料的预培养

1．2．3 农杆菌侵染

1．2．4 共培养、筛选培养、继代培样

1．2．5 影响农杆菌转化效果的因素

1．2．5．1 菌液浓度和侵染时间

1．2．5．2 选择培养中抑菌抗生素及浓度的确定

1．2．5．3 预培养时间

1．2．5．4 共培养时间

1．2．5．5 选择方式

1．2．6 生根培养

1．2．7 转基因草莓的分子生物学鉴定

1．2．7．1 草莓基因组DNA的快速提取(改良SDS法)

1．2．7．2 PCR检测

1．2．7．3 Southern杂交

1．2．7．3．1 草莓基因组DNA的提取

1．2．7．3．2 草莓基因组DNA的酶切

1．2．7．3．3 电泳及转膜

1．2．7．3．4 探针制备及标记

1．2．7．3．5 杂交

2 结果

2．1 菌液浓度对转化效率的影响

2．2 侵染时间对转化效率的影响

2．3 预培养时间对转化率的影响

2．4 共培养时间对转化率的影响

2．5 抗生素对农杆菌的抑菌效果

2．6 筛选方式对转化率的影响

2．7 草莓转APD基因植株和转INS基因愈伤组织的获得

2．8 转基因草莓植株的检测

2．8．1 PCR鉴定

2．8．1．1 草莓APD基因转化株的检测

2．8．1．2 草莓INS基因转化愈伤组织的检测PCR鉴定

2．8．2 转基因草莓的Southern blot分析

3 讨论

参考文献

ABSTRACT

博士期间发表的论文

发布时间: 2005-07-22

参考文献

• [1].cNHX1基因的融合、功能鉴定和对转基因草莓耐盐性影响的研究[D]. 魏振林.山东农业大学2004
• [2].草莓再生体系的建立及导入chit42基因获得抗病种质的研究[D]. 谢志兵.湖南农业大学2007

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