基于LDR-PCR通用寡核苷酸芯片同时检测十种马铃薯病毒研究

论文摘要

实验目的:在生物有机体检测中的靶标存在多样性、复杂性、物种组成以及特性的差异,因此建立一种统一的检测手段代替多个不同的专门方法就显得非常重要。本研究拟以苜蓿花叶病毒（Alfalfa mosaic virus, AMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）、马铃薯卷叶病毒（Potato leaf roll virus, PLRV）、马铃薯A病毒（Potato Virus A, PVA）、马铃薯M病毒（Potato Virus M, PVM）、马铃薯S病毒（Potato Virus S, PVS）、马铃薯X病毒（Potato Virus X , PVX）、马铃薯Y病毒（Potato Virus Y, PVY）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）、烟草环斑病毒（Tobacco ringspot virus, TRSV）十种马铃薯病毒作为靶标对象,建立一种特异性强、灵敏度高、多重性好、通用性广可同时检测多种病原体的技术平台。实验方法:提取马铃薯病毒的总RNA,利用六聚体随机引物或特异性反向引物将RNA逆转录为cDNA,再利用特异性引物扩增每一种马铃薯病毒cDNA,并进行目标片段克隆和PCR电泳测序鉴定,经纯化含目标病毒保守片段的质粒作为检测系统优化的标准品。在每一种病毒的引物序列之间设计两条首尾相连的上、下游鉴别探针。上游鉴别探针序列3′端与上游通用序列的5′端相连组成上游LDR（Ligase detection reaction,连接酶检测反应）探针,同样用于基因芯片点制的Zip-code序列的5′和3′端分别与下游通用序列以及下游鉴别探针序列相连组成下游LDR探针。每种病毒的LDR探针在相应的靶序列存在且在Taq DNA连接酶作用下可连接形成100 bp左右的寡核苷酸产物。每种病毒的LDR连接产物都具有相同的通用序列和唯一对应的Zip-code序列。然后经通用引物不对称标记扩增,将连接扩增产物（含Zip-code互补序列）与基因芯片Zip-code序列进行杂交检测。在单病毒单重LDR-PCR基因芯片特异性检测的基础上,分别进行单病毒多重LDR-PCR优化实验,单种与两种混合病毒多重LDR-PCR基因芯片病毒特异性、灵敏度实验,十种病毒多重LDR-PCR基因芯片多重性实验,最后将建立的多重LDR-PCR基因芯片检测平台应用于田间样品检测。实验结果:主要有五个方面,①单病毒单重LDR-PCR电泳与芯片杂交检测表明设计的LDR探针具有非常高的检测特异性。②单病毒多重LDR-PCR体系的优化参数为:最适Taq DNA连接酶酶量为0.1 U,最适混合探针中每对探针分别为0.1 pmol,最适循环数为35个,最佳退火时间为4 min,最佳退火温度为58°C。③单病毒与两种混合病毒多重LDR-PCR基因芯片杂交检测具有较高的灵敏度,最低病毒检测量均为3 copies;检测体系具有较高的特异性,每一种病毒经反转录、LDR、PCR和芯片杂交后,仅在靶标位点产生强的荧光信号,而非靶标病毒则无阳性信号。④十种病毒多重LDR-PCR基因芯片杂交结果表明该方法检测的多重性好,可同时检测多种病毒。⑤应用多重LDR-PCR基因芯片检测79个田间样品,十种病毒的阳性检出率最低为2.53%,最高达到44.30%,高于普通PCR方法的阳性检出率（0-39.24%）。实验结论:本研究将多重LDR,PCR与通用寡核苷酸基因芯片技术结合,通过引入通用序列和Zip-code通用杂交序列,建立了一种特异性强、灵敏性高、多重性好、通用性广的可检测10种马铃薯病毒的检测技术,而且此技术还可用于临床、兽医、食品、生物安全、环境监测和基因诊断中基因遗传变异等领域。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 马铃薯概述
• 1.2 马铃薯病毒病
• 1.2.1 马铃薯病毒简介
• 1.2.1.1 苜蓿花叶病毒
• 1.2.1.2 黄瓜花叶病毒
• 1.2.1.3 马铃薯卷叶病毒
• 1.2.1.4 马铃薯A 病毒和马铃薯Y 病毒
• 1.2.1.5 马铃薯M 病毒和马铃薯S 病毒
• 1.2.1.6 马铃薯X 病毒
• 1.2.1.7 烟草花叶病毒
• 1.2.1.8 烟草环斑病毒
• 1.2.2 病毒病导致马铃薯退化的原因及防治措施
• 1.3 马铃薯病毒的检测研究进展
• 1.3.1 传统的生物学方法
• 1.3.1.1 指示植物检测法
• 1.3.1.2 电镜技术
• 1.3.2 以蛋白为基础的免疫学方法
• 1.3.2.1 ELISA
• 1.3.2.2 DIBA
• 1.3.3 核酸介导的分子生物学检测方法
• 1.3.3.1 dsRNA 电泳技术
• 1.3.3.2 PCR 检测技术
• 1.3.3.2.1 普通PCR 检测技术
• 1.3.3.2.2 多重PCR 检测技术
• 1.3.3.2.3 荧光定量PCR 检测
• 1.3.3.3 核酸分子杂交技术
• 1.3.3.3.1 核酸斑点杂交技术
• 1.3.3.3.2 基因芯片技术
• 1.4 研究的目的和意义
• 1.5 研究的内容
• 1.6 技术路线
• 1.7 研究的创新点、重点、难点和关键问题
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 毒源及其田间样品
• 2.1.2 主要酶和试剂
• 2.2 引物与寡核苷酸设计
• 2.2.1 特异性引物的设计
• 2.2.2 鉴别探针的设计
• 2.2.3 Zip-code 和通用序列的筛选
• 2.2.4 LDR 探针序列的确定
• 2.3 十种马铃薯病毒的总RNA 提取及其检测
• 2.4 LDR 反应模板的获得
• 2.4.1 单个病毒PCR 目的片段模板获得
• 2.4.2 PCR 目的片段的连接与转化
• 2.4.3 重组质粒的转化、提取及其鉴定
• 2.4.4 RT 模板的获得
• 2.5 LDR-PCR 反应体系的建立
• 2.5.1 单重LDR-PCR 基因芯片检测的特异性
• 2.5.2 单病毒多重LDR-PCR 优化
• 2.5.2.1 单病毒多重LDR-PCR 不同酶量优化
• 2.5.2.2 单病毒多重LDR-PCR 不同浓度探针优化
• 2.5.2.3 单病毒多重LDR-PCR 不同循环数优化
• 2.5.2.4 单病毒多重LDR-PCR 不同退火时间优化
• 2.5.2.5 单病毒多重LDR-PCR 不同退火温度优化
• 2.5.3 单病毒多重LDR-PCR 基因芯片检测特异性
• 2.5.4 单病毒多重LDR-PCR 基因芯片最低检测模板量测定
• 2.5.5 两种病毒模板的多重LDR-PCR 基因芯片反应灵敏度检测
• 2.5.6 十种病毒模板的多重LDR-PCR 基因芯片检测
• 2.6 芯片的制备
• 2.6.1 点样
• 2.6.2 烘干
• 2.7 玻片杂交与分析
• 2.7.1 预杂交
• 2.7.2 杂交
• 2.7.3 扫描分析
• 2.8 田间样本的检测
• 第三章 结果与分析
• 3.1 十种马铃薯病毒总RNA 提取
• 3.2 十种马铃薯病毒RT-PCR 扩增
• 3.3 单重LDR-PCR 特异性检测
• 3.4 不同酶量单病毒多重LDR-PCR
• 3.5 不同浓度探针单病毒多重LDR-PCR
• 3.6 不同循环数单病毒多重LDR-PCR
• 3.7 不同退火时间单病毒多重LDR-PCR
• 3.8 不同退火温度单个病毒多重LDR-PCR
• 3.9 单病毒多重LDR-PCR 特异性检测
• 3.10 单病毒多重LDR-PCR 模板灵敏度检测
• 3.11 两种混合病毒多重LDR-PCR 基因芯片的检测灵敏度
• 3.12 十种病毒多重LDR-PCR 基因芯片检测
• 3.13 田间样本检测
• 第四章 讨论与分析
• 4.1 多重LDR-PCR 检测方法的选择
• 4.2 通用寡核苷芯片杂交技术的选择
• 4.3 Cy5-dCTP 荧光标记不对称PCR 检测方法的选择
• 4.4 田间样品的检测
• 4.5 存在的问题及其展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表（投稿）的论文