论文摘要
本研究通过建立多年生黑麦草（Lolium perenne L.）高频再生体系,应用基因枪和农杆菌介导法将DREB1A和BADH-CMO基因导入胚性愈伤组织,获得正常生长的抗性增强的可育转基因植株;通过人工授粉和自由杂交方式获得转基因子代,并研究了其萌发、盆栽和田间生长特性;建立了快速检测多年生黑麦草转基因植株潮霉素（hyg）抗性的方法和抗旱子代筛选体系;综合评价了转基因多年生黑麦草的安全性。通过5年多的研究,在以下几个方面取得了进展:1、选择适宜品种,以胚为外植体,建立多年生黑麦草高频再生体系,使愈伤诱导率达到97.9%,胚性愈伤率达到19.4%,分化率可达90.9%。2、建立起多年生黑麦草遗传转化筛选系统:愈伤培养阶段添加hyg 100mg/L,筛选30d;植株再生阶段50mg/L,筛选至有芽长出后移入不含hyg的生根培养基中。农杆菌介导转化时以头孢霉素（cef）为抑菌剂,愈伤培养阶段添加300mg/L,植株再生阶段250mg/L。3、建立多年生黑麦草基因枪遗传转化体系:以0.5～1mm间的胚性愈伤组织为受体,金粉直径1μm,采用Ca（NO3）2+PEG4000作为DNA沉淀剂,6cm高度下轰击2次。获得转DREB1A基因爱神特转基因株系（ATR）68个,特拉华转基因株系（DTR）7个,尤文图斯转基因株系（JTR）18个;转BADH-CMO基因爱神特转基因株系（ABC）15个,三个品种的平均抗性绿苗率为11.1%。4、建立多年生黑麦草农杆菌介导遗传转化体系:以预培养5d的胚性愈伤组织为受体,采用OD600=0.1左右的农杆菌菌液侵染10min,期间进行抽真空和晃动处理。去除菌液后,共培养4d,以500mg/L cef清洗后筛选,获得转DREB1A基因爱神特转基因株系（AGR）14个。5、转基因多年生黑麦草在温室和田间均可正常生长,盆栽ATR、AGR和ABC较ACK生长速度减慢,田间ATR、AGR、JTR、DTR与对照植株无明显差异,但ABC的生长受到严重抑制。外源基因的插入不仅使转基因植株的抽穗时间提前,还导致其穗长变短,尤其是BADH-CMO基因显著降低了ABC的穗长。DREB1A基因使转基因植株的抽穗个数略有提高,而BADH-CMO基因则使其显著降低。转基因植株较对照植株具有更高的抗旱、越冬和耐盐性,但抵御病害的能力明显下降,在对抗虫害方面二者无明显差异。除ABC外,转基因植株均能结实。6、采用人工授粉和隔离杂交两种方式获得大量转基因子代,T1代种子具有较高的发芽势和发芽率。以JTR为父母本的种子的发芽势具明显优势,以AGR为母本的种子的平均发芽势最低,以DTR为父本的种子的平均发芽势最低。T1代7天的平均芽长和根长分别为3.9cm和3.2cm。以JTR为父母本的种子,平均芽长最长,而以AGR为父母本种子,平均芽长最短。田间JTR的子代表现最优,以DCK和ATR-12为母本自由杂交的子代出苗势和出苗率均达100%。自由杂交授粉比人工授粉的种子具有更高的田间出苗势、出苗率、苗高和分蘖数,即使同一母本所得种子的萌发能力也不同。7、hyg和PEG对爱神特种子的萌发具有极显著影响,75mg/L hyg将发芽势降至44.8%,但发芽率仍达61.5%,hyg不适合在萌发期筛选转基因子代。15%的PEG只能使极个别种子发芽,20%则完全不能发芽。以15%的PEG筛选转基因T1代种子,推测的外源基因分离规律均低于孟德尔遗传定律。8、建立快速检测多年生黑麦草转基因植株hyg抗性的方法:1mg/L 6-BA+50mg/L hyg可用于多年生黑麦草离体叶片段的筛选,第8天时的褐化情况可作为初步筛选转基因植株的依据。盆栽T1代经干旱筛选后恢复生长的植株进行hyg叶片筛选,经筛选后的植株进行PCR检测全部呈阳性,初步说明外源基因在植物体内能够稳定遗传。9、转DREB1A和转BADH-CMO基因多年生黑麦草属于安全等级为I级的转基因植物,已经国家林业局生物安全处批准进行中间试验。
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摘要ABSTRACT缩写词第1章 综述1.1 草坪草遗传转化研究进展概述1.1.1 草坪草组织培养和再生体系的建立1.1.1.1 外植体的来源1.1.1.2 愈伤组织的诱导1.1.1.3 悬浮细胞培养1.1.1.4 原生质体培养1.1.1.5 植株的再生培养1.1.2 草坪草基因转化体系的建立1.1.2.1 将DNA 直接导入原生质体1.1.2.2 碳硅纤维介导的转化1.1.2.3 基因枪法1.1.2.4 农杆菌介导的转化1.1.3 转基因草坪草的筛选和鉴定1.1.3.1 选择系统的建立1.1.3.2 报告基因的表达检测1.1.3.3 转基因草坪草的分子生物学检测1.1.3.4 转基因草坪草的性状鉴定1.1.3.5 其他转基因植物鉴定方法1.1.4 转基因技术在草坪草品种改良中的应用1.1.4.1 草坪草抗除草剂基因工程1.1.4.2 草坪草抗病虫基因工程1.1.4.3 草坪草抗逆基因工程1.1.4.4 调控花粉过敏原1.1.4.5 调控花期1.2 多年生黑麦草遗传转化研究进展概述1.2.1 多年生黑麦草组织培养和再生体系的建立1.2.1.1 外植体的选择1.2.1.2 悬浮培养体系的建立1.2.1.3 愈伤组织的诱导与分化1.2.1.4 基因型的影响1.2.2 多年生黑麦草的遗传转化1.2.2.1 基因枪转化法1.2.2.2 农杆菌介导转化法1.2.2.3 其它转化方法的应用1.3 本研究涉及到的相关基因概述1.3.1 DRE81A 基因的发现、改造以及功能的研究进展1.3.1.1 AP2/EREBP 转录因子家族1.3.1.2 DREB 转录因子与抗逆性1.3.2 BADH、CMO 基因的发现、改造及其功能的研究进展1.3.2.1 胆碱单氧化酶蛋白的分离纯化和特性研究1.3.2.2 胆碱单氧化酶的基因工程1.3.2.3 甜菜碱醛脱氢酶蛋白的分离纯化和特性研究1.3.2.4 甜菜碱醛脱氢酶的基因工程1.4 转基因植物的遗传稳定性1.4.1 转基因植物中外源基因的丢失1.4.2 转基因植物中外源基因的次生效应1.4.3 转基因植物中的基因沉默1.4.4 转基因生物中外源基因的逃逸1.4.5 外源基因在后代中的遗传多样性1.5 转基因植物的安全性1.5.1 转基因植物的应用现状及生物安全评价的必要性1.5.1.1 生物安全的概念和忧患1.5.1.2 转基因植物的应用现状1.5.1.3 转基因植物安全性评价的必要性1.5.2 国际社会对转基因生物安全的态度与规则1.5.2.1 科学界对转基因植物的态度1.5.2.2 部分国家、国家联盟和地区的转基因植物安全性管理1.5.3 中国转基因植物的管理办法1.5.3.1 中国科学界对转基因植物的争议1.5.3.2 中国转基因植物安全性管理的原则1.5.3.3 中国转基因植物安全评价方法的主要内容1.5.3.4 安全控制措施1.5.4 外源基因对受体植物的影响1.5.4.1 标记基因对受体植物的影响1.5.4.2 外源基因对受体植物的影响1.5.5 转基因植物的生态安全性1.5.5.1 转基因植物的杂草化问题1.5.5.2 农田生态系统的潜在风险1.5.5.3 自然生态系统的潜在风险1.5.5.4 基因污染和转基因逃逸1.5.5.5 可能诱发害虫和野草抗性1.5.5.6 可能诱发自然生物种群改变1.5.6 转基因植物的健康安全性1.5.6.1 毒性1.5.6.2 过敏性反应1.5.6.3 抗药性1.5.6.4 有益成分1.5.6.5 免疫力1.6 本研究的意义和内容1.6.1 选题背景和研究意义1.6.2 研究内容1.6.3 技术路线第2章 多年生黑麦草高频再生体系的建立2.1 材料与方法2.1.1 植物材料2.1.2 外植体的消毒与接种2.1.3 培养基2.1.4 愈伤组织的诱导与继代培养2.1.5 愈伤组织的分化培养与移栽2.1.6 试验设计2.1.6.1 外植体的选择2.1.6.2 基因型对愈伤诱导和分化的影响2.1.6.3 植物激素对愈伤诱导的影响2.1.6.4 酸水解酪蛋白对愈伤组织诱导的影响2.1.6.5 植物激素对植株分化的影响2.1.7 数据统计2.2 结果与分析2.2.1 外植体对愈伤诱导的影响2.2.1.1 D、J 不同外植体愈伤诱导的比较2.2.1.2 七个品种不同外植体愈伤诱导的比较2.2.2 基因型对愈伤组织诱导及分化的影响2.2.2.1 七个品种愈伤诱导的比较2.2.2.2 品种间综合比较2.2.3 植物激素对愈伤诱导的影响2.2.3.1 植物激素对D、J 愈伤诱导的影响2.2.3.2 植物激素对A、Ds 愈伤诱导的影响2.2.4 酸水解酪蛋白对愈伤诱导的影响2.2.5 植物激素对植株分化的影响2.2.5.1 D、J 植株再生正交试验2.2.5.2 A、Ds 植株再生的正交试验2.3 结论与讨论2.3.1 外植体的选择2.3.2 基因型对愈伤组织诱导及分化的影响2.3.3 愈伤组织的诱导和继代2.3.4 愈伤组织的再生培养2.3.5 微量元素及有机附加物的影响2.4 小结第3章 多年生黑麦草的遗传转化3.1 材料与方法3.1.1 受体植物材料3.1.2 表达载体3.1.3 培养基3.1.4 质粒DNA 的制备3.1.4.1 大肠杆菌受体细菌的培养3.1.4.2 大肠杆菌感受态细胞的制备3.1.4.3 质粒的转化3.1.4.4 质粒DNA 的提取3.1.4.5 DNA 浓度和纯度检测3.1.5 重组质粒由大肠杆菌向农杆菌中转移3.1.5.1 土壤农杆菌感受态的制备3.1.5.2 农杆菌的转化3.1.5.3 阳性农杆菌的鉴定及用于转化的阳性农杆菌的制备3.1.6 筛选系统的建立3.1.7 基因枪法转化3.1.7.1 金粉DNA 复合体的制备3.1.7.2 受体材料的处理3.1.7.3 受体材料的轰击3.1.7.4 基因枪转化体系各影响因素的确定3.1.7.5 gus 基因表达的检测3.1.8 农杆菌介导法转化3.1.8.1 农杆菌的培养与活化3.1.8.2 抑菌素浓度的确定3.1.8.3 供体菌株培养3.1.8.4 侵染3.1.9 抗性筛选和植株再生3.1.9.1 基因枪转化后的过度、筛选培养和植株再生3.1.9.2 农杆菌介导转化后的筛选培养和植株再生3.1.10 抗性苗的生根培养和移栽3.1.11 数据统计3.2 结果与分析3.2.1 筛选系统的建立3.2.2 gus 基因的瞬时和稳定表达3.2.3 基因枪转化体系的建立3.2.3.1 受体材料的影响3.2.3.2 DNA 包被物质和轰击次数的选择3.2.3.3 金粉直径和轰击高度的选择3.2.3.4 抗性植株的获得3.2.3.5 基因型对基因枪转化效率的影响3.2.3.6 多年生黑麦草基因枪转化体系3.2.4 农杆菌介导转化体系的建立3.2.4.1 抑菌素浓度的确定3.2.4.2 菌液浓度、侵染时间和共培养时间对转化效率的影响3.2.4.3 抗性植株的获得3.2.4.4 多年生黑麦草农杆菌介导遗传转化体系3.3 结论与讨论3.3.1 筛选系统3.3.2 多年生黑麦草基因枪遗传转化体系3.3.2.1 受体材料3.3.2.2 DNA 包被物质3.3.2.3 轰击次数3.3.2.4 金粉直径3.3.2.5 轰击高度3.3.2.6 基因型对基因枪转化体系的影响3.3.2.7 其它影响因素3.3.3 多年生黑麦草农杆菌介导遗传转化体系3.3.3.1 受体材料3.3.3.2 菌液浓度3.3.3.3 侵染方式与侵染时间3.3.3.4 共培养时间3.3.3.5 乙酰丁香酮的影响3.4 小结第4章 抗性植株的分子检测4.1 材料与方法4.1.1 植物材料4.1.2 植物DNA 的提取4.1.2.1 SDS 法提取植物DNA4.1.2.2 试剂盒（CTAB）法提取植物DNA4.1.2.3 DNA 的纯化4.1.2.4 DNA 质量检测4.1.3 抗性植株的PCR 分析4.1.3.1 PCR 扩增引物4.1.3.2 PCR 扩增体系4.1.3.3 PCR 反应条件4.1.4 Southern 印迹杂交4.1.4.1 试剂配制4.1.4.2 探针标记4.1.4.3 Southern 杂交方法4.1.5 植物RNA 的提取4.1.5.1 准备工作4.1.5.2 RNA 的提取步骤4.1.5.3 RNA 完整性及纯度检测4.1.6 Northern 印迹杂交4.1.6.1 按大小分离RNA，进行RNA 甲醛电泳4.1.6.2 RNA 的转膜4.1.6.3 探针标记4.1.6.4 Northern 杂交方法4.1.6.5 酶联免疫显色4.2 结果与分析4.2.1 植物DNA 的提取4.2.1.1 SDS 法提取植物DNA4.2.1.2 试剂盒（CTAB）法提取植物DNA4.2.2 抗性植株的PCR 扩增4.2.2.1 基因枪法转DRE81A 基因多年生黑麦草的PCR 扩增4.2.2.2 农杆菌介导法转DRE81A 基因多年生黑麦草的PCR 扩增4.2.2.3 基因枪法转BADH-CMO 基因多年生黑麦草的PCR 扩增4.2.3 抗性植株的PCR-Southern 印迹杂交4.2.3.1 探针标记效率4.2.3.2 转基因植株的PCR-Southern 杂交4.2.4 抗性植株的Northern 印迹杂交4.2.5 转基因植株的获得4.3 结论与讨论4.3.1 植物DNA 的提取4.3.2 PCR 扩增4.3.3 Southern 印迹杂交4.3.4 Northern 印迹杂交4.4 小结第5章 转基因植株的性状鉴定和田间观测5.1 材料与方法5.1.1 植物材料5.1.2 盆栽转基因植株生长状况的观测5.1.2.1 盆栽转基因植株的管理5.1.2.2 盆栽转基因植株生长速度观测5.1.3 盆栽转基因植株的抗旱性检测5.1.3.1 抗旱试验植物材料5.1.3.2 测试方法和测量指标5.1.4 转基因植株的田间观测5.1.4.1 试验地点介绍5.1.4.2 田间管理和观测5.1.4.3 田间病虫害观测5.1.4.4 田间抗逆性观测5.2 结果与分析5.2.1 盆栽转基因多年生黑麦草的生长状况5.2.2 盆栽转基因植株抗旱能力的提高5.2.2.1 基因枪法转DRE81A 基因多年生黑麦草抗旱能力的提高5.2.2.2 农杆菌介导法转DRE81A 基因多年生黑麦草抗旱能力的提高5.2.3 转基因多年生黑麦草的田间生长状况5.2.3.1 田间生长和发育状况观测5.2.3.2 田间抗病虫害能力的观测5.2.3.3 田间抗性观测5.3 结论与讨论5.3.1 外源基因的表达对转基因多年生黑麦草生长状况的影响5.3.2 外源基因的表达对转基因多年生黑麦草抗性的影响5.3.3 外源基因在不同基因型中的表达5.3.4 转化方法对外源基因表达的影响5.4 小结第6章 转基因多年生黑麦草子代研究6.1 材料与方法6.1.1 植物材料6.1.2 人工授粉方法与组合6.1.3 种子的收获6.1.4 子代种子的发芽试验6.1.5 子代种子萌发期的筛选6.1.5.1 多年生黑麦草种子对潮霉素的敏感度试验6.1.5.2 多年生黑麦草种子对PEG 胁迫的敏感度试验6.1.5.3 T1 代种子萌发期的干旱筛选6.1.6 T1 代盆栽干旱筛选6.1.7 叶片抗潮霉素筛选6.1.7.1 6-BA 浓度的选择6.1.7.2 多年生黑麦草离体叶片段对潮霉素的敏感度测试6.1.7.3 转基因植株对潮霉素敏感度测试6.1.7.4 T1 代叶片的潮霉素筛选6.1.8 T1 代的分子检测6.1.9 T1 代的田间生长观测及T2 代种子的获得6.1.9.1 T1 代在田间的出苗状况6.1.9.2 T1 代田间生长状况的观测6.1.9.3 T2 代种子的获得6.2 结果与分析6.2.1 转基因多年生黑麦草子代的获得6.2.2 T1 代发芽状况分析6.2.3 子代种子萌发期的筛选6.2.3.1 潮霉素对多年生黑麦草种子萌发的影响6.2.3.2 干旱胁迫对多年生黑麦草种子萌发的影响6.2.3.3 T1 代种子萌发期的干旱胁迫筛选6.2.4 T1 代盆栽生长观测和干旱胁迫6.2.5 叶片抗潮霉素筛选6.2.5.1 6-BA 浓度的选择6.2.5.2 多年生黑麦草离体叶片段对潮霉素敏感度的测试6.2.5.3 转基因植株对潮霉素敏感度测试6.2.5.4 快速检测转基因多年生黑麦草潮霉素抗性方法的建立6.2.5.5 快速检测转基因多年生黑麦草潮霉素抗性方法的应用6.2.6 T1 代分子检测6.2.7 T1 代的田间生长状况和T2 代的获得6.2.7.1 T1 代的田间生长状况6.2.7.2 T2 代的获得6.3 结论与讨论6.3.1 人工授粉、杂交与子代的获得6.3.2 转基因子代种子萌发期的特征6.3.2.1 子代种子的发芽6.3.2.2 潮霉素对种子萌发的影响6.3.2.3 模拟干旱对种子萌发的影响6.3.3 叶片法筛选转基因多年生黑麦草转基因植株6.3.3.1 6-BA 的持绿作用6.3.3.2 快速检测转基因多年生黑麦草潮霉素抗性的方法6.3.4 外源基因的分离规律和遗传稳定性6.3.5 转基因子代植株苗期及田间的生长6.4 小结第7章 转基因多年生黑麦草的安全性评价7.1 材料与方法7.1.1 植物材料7.1.2 试验地点7.1.3 安全措施7.1.4 安全评价方法和评价体系7.2 结果与分析7.2.1 受体植物的安全性评价7.2.1.1 受体植物的历史背景7.2.1.2 受体植物的生物学特性7.2.1.3 受体植物在我国的分布、生长发育的生态环境条件7.2.1.4 受体植物与相关物种的关系7.2.1.5 受体植物的综述7.2.2 基因操作的安全性评价7.2.2.1 目的基因的用途及基因产物的功能7.2.2.2 载体的名称、来源和致病性7.2.2.3 启动子和终止子及其来源7.2.2.4 标记基因和报告基因的名称及其来源7.2.2.5 转基因方法7.2.2.6 转基因植物选择筛选系统7.2.3 转基因植物及其产品的安全性评价7.2.3.1 目的基因的发育特异性、组织特异性7.2.3.2 遗传稳定性7.2.3.3 转基因植物及其产品的特征变化7.3 讨论7.4 小结第8章 结论参考文献附图个人简介导师简介致谢
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