反义RNA抑制番茄DHS基因表达的研究

论文摘要

脱氧羟腐胺赖氨酸合酶（deoxyhypusine synthase, DHS）在植物、哺乳动物和酵母细胞中普遍存在,参与真核翻译起始因子eIF-5A （eukaryotic initiationfactor-5A）的翻译后活化。DHS负责将亚精胺的丁胺基团转移到eIF-5A前体的第50位保守赖氨酸残基上,产生稀有氨基酸-脱氧羟腐胺赖氨酸（deoxyhypusine）,然后通过脱氧羟腐胺赖氨酸羟化酶（deoxyhypusine hydroxylase,DHH）的作用,将外来的丁胺基团羟化,形成羟腐胺赖氨酸（hypusine）。eIF-5A前体经羟腐胺赖氨酸修饰变成有活性的蛋白。eIF-5A是DHS惟一已知底物,是迄今为止惟一发现的含稀有氨基酸羟腐胺赖氨酸残基的蛋白质。植物、哺乳动物和酵母中的研究表明eIF-5A与细胞增殖及衰老关系密切。抑制DHS基因的表达,可以阻止eIF-5A的翻译后活化,从而产生促进细胞增殖,延缓衰老等效应。本研究以基因工程模式作物番茄作为试验材料,通过RT-PCR、构建反义表达载体、农杆菌侵染等实验方法,利用反义RNA技术抑制番茄DHS基因的表达,实时荧光定量PCR检测结果表明,DHS基因表达被抑制,而且DHS基因抑制型番茄的叶片叶绿素含量增加,衰老得到延缓。从而为深入研究农作物、药用植物和名贵花卉的衰老延缓以及植物的遗传改良奠定了基础。

论文目录

• 内容提要
• 符号、缩略语词表
• 第1章 绪论
• 1.1 脱氧羟腐胺赖氨酸合酶（DHS）与真核翻译起始因子（eIF-5A）的关系
• 1.1.1 eIF-5A的结构与保守性特征
• 1.1.2 不同同工型的eIF-5A
• 1.1.3 eIF-5A的功能
• 1.1.4 DHS对eIF-5A的作用机制
• 1.1.5 DHS的结构特征
• 1.1.6 GC7对 DHS的抑制
• 1.1.7 抑制DHS表达对植物的影响
• 1.2 反义技术
• 1.2.1 反义技术的分类
• 1.2.2 反义技术在植物中的应用
• 1.3 研究目的和意义
• 第2章 番茄DHS基因克隆
• 2.1 前言
• 2.1.1 RT-PCR 反应原理
• 2.1.2 基因克隆技术原理
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 番茄总RNA提取
• 2.3.2 总RNA纯度测定结果
• 2.3.3 RT-PCR结果分析
• 2.3.4 大肠杆菌蓝白斑筛选结果
• 2.3.5 阳性克隆PCR鉴定结果
• 2.3.6 RT-PCR扩增片段测序结果
• 2.4 讨论
• 2.4.1 番茄总RNA提取
• 2.4.2 RT-PCR引物设计与反应条件
• 2.4.3 克隆载体的选择
• 2.4.4 RT-PCR产物与克隆载体的连接
• 2.4.5 大肠杆菌感受态细胞制备
• 2.4.6 重组子的蓝白斑筛选
• 2.4.7 RT-PCR扩增片段的测序
• 2.5 小结
• 第3章 番茄DHS基因的反义表达载体的构建
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 pMD19-DHS重组质粒的酶切
• 3.3.2 pCAMBIA1302质粒的酶切
• 3.3.3 反义表达载体的鉴定
• 3.4 讨论
• 3.4.1 质粒DNA的提取
• 3.4.2 限制性内切酶的酶切
• 3.4.3 pCAMBIA1302载体
• 3.5 小结
• 第4章 农杆菌介导的番茄pCAMBIA-antiDHS遗传转化
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 阳性LBA4404的PCR鉴定
• 4.3.2 潮霉素选择压浓度的选择
• 4.3.3 分化培养基中细胞分裂素（6-BA）和生长素（IAA）浓度的 选择
• 4.3.4 不同外植体的发芽率
• 4.4 讨论
• 4.4.1 生长素和细胞分裂素在植物器官分化中的作用
• 4.5 小结
• 第5章 转基因番茄的实时荧光定量 PCR遗传转化鉴定及叶绿素含量测定
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 试剂与仪器
• 5.2.2 实验方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 利用实时荧光定量 PCR对 DHS和eIF-5A基因表达水平的分析
• 5.3.2 叶绿素含量测定
• 5.3.3 抑制DHS基因表达产生的生长停滞型番茄
• 5.4 讨论
• 5.4.1 实时荧光定量 PCR是鉴定基因表达水平的有效方法
• 5.4.2 实时荧光定量PCR引物的设计要求
• 5.4.3 实时荧光定量PCR反应中内参的选择
• 5.4.4 抑制DHS基因表达对番茄的影响
• 5.5 小结
• 第6章 总结与展望
• 6.1 总结
• 6.2 展望
• 参考文献
• 博士期间发表文章及参与科研课题
• 致谢
• 中文摘要
• Abstract