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ABA8’-羟化酶基因的功能鉴定及应用研究

2020-12-02阅读(839)

ABA8’-羟化酶基因的功能鉴定及应用研究

论文摘要

穗发芽（Preharvest sprouting,简称PHS）是小麦生产上的世界性重要灾害。在收获期遇到阴雨天气或涛湿环境下,小麦穗上发芽可造成产量损失达10%以上,籽粒储藏物特别是淀粉的分解,严重影响到小麦的加工品质,带来仓储时霉变等多方面的经济损失。穗发芽不仅降低产量而且严重劣化品质和种用价值,如何提高品种的抗穗发芽能力是小麦遗传育种研究长期面临的重要课题。穗发芽是一个典型的受环境和基因型互作系统控制的复杂性状,但基因型控制的籽粒发芽能力是影响穗发芽的内在决定因素。基因型影响小麦穗发芽的因素极其复杂,其中种子休眠特性是影响穗发芽抗性的主导因素。植物激素,特别是脱落酸（ABA）和赤霉素（GA）,在种子成熟及萌发过程中起着重要的调节作用。ABA诱导和维持胚休眠并抑制萌发,而GA可以解除休眠促进萌发。ABA8’一羟化酶是ABA分解代谢途径中的关键酶。研究表明,拟南芥和大麦的ABA8’一羟化酶编码基因在休眠和不休眠种子间表达差异显著,休眠种子中ABA含量高于非休眠种子,且萌发速度明显推迟,该基因对种子萌发过程中ABA激素水平的变化起着重要作用,是影响种子从休眠向萌发阶段转化的关键基因。为了进一步证实大麦ABA8’一羟化酶基因HvABA8’OH-1是否与种子萌发密切相关,本研究将构建的大麦HvABA8’OH-1基因表达载体,转入拟南芥ABA8’一羟化酶基因Atcyp707a2的突变体,种子萌发实验结果表明:转基因植株种子萌发率已恢复到野生型水平,二者均明显高于突变体,说明HvABA8’OH-1的确是影响种子萌发的重要基因。同时,为了鉴定AtCYP707A2基因启动子表达的组织特异性,我们构建一个带GUS基因的载体转入Columbia野生型,染色结果表明,GUS在莲座叶和老叶的表皮毛上有较多的表达,在花瓣、柱头、花序的基部和外周也都有表达,比较符合基因芯片的结果。ABA8’一羟化酶基因是进化上较为保守的一类基因,通过RNA干扰（RNAi）降低该基因在种子中的表达水平,可能会为人工调控种子萌发提供一条新途径。为此,利用水稻胚特异性启动子、HvABA8’OH-1基因的保守和特异序列分别构建了两个能转录形成发卡RNA的表达载体,并采用茎尖转化文法将其整合到小麦基因组内,以期通过RNAi沉默抑制小麦同源基因表达,达到增强种子休眠、延迟种子萌发的目的。经除草剂筛选和PCR检测最后得到27株T1阳性植株,转化率为4.57%,为下一步分析转基因植株种子的穗发芽抗性奠定了基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  • 1 小麦的穗发芽
  • 2 植物的休眠
  • 3 植物休眠在农作物中的意义
  • 4 影响植物休眠的主要遗传因素
  • 4.1 穗发芽QTLs研究
  • 4.2 植物激素与休眠
  • 5 种子休眠和ABA
  • 5.1 ABA的代谢途径
  • 5.2 CYP707A基因家族与ABA代谢
  • 6 ABA的效应基因与植物休眠
  • 7 研究的目的意义
  • 8 研究技术路线
  • 第二章 材料与方法
  • 1 试验材料
  • 1.1 植物材料
  • 1.2 菌种和质粒
  • 1.3 主要试剂和仪器
  • 1.3.1 主要试剂
  • 1.3.2 主要仪器
  • 2 试验方法
  • 2.1 菌种的培养和保存
  • 2.2 大肠杆菌质粒DNA的提取
  • 2.3 感受态胞的制备和转化
  • 2.3.1 大肠感菌感受态细胞的制备和转化
  • 2.3.2 农杆菌感受态细胞的制备和转化
  • 2.4 DNA片断的回收
  • 2.4.1 酶切产物的纯化
  • 2.4.2 DNA快速纯化
  • 2.5 植物总RNA提取
  • 2.6 PCR
  • 2.6.1 rTaq PCR反应
  • 2.6.2 Phusion PCR反应
  • 2.7 RT-PCR
  • 2.8 植物基因组DNA的提取
  • 2.8.1 拟南芥基因组DNA的快速提取法
  • 2.8.2 小麦叶片DNA的提取法
  • 2.9 拟南芥种子的消毒与铺板
  • 2.10 拟南芥的转化
  • 2.11 拟南芥种子的萌发实验
  • 2.12 GUS染色
  • 2.13 小麦转化
  • 2.13.1 小麦种子的消毒处理
  • 2.13.2 小麦种子的春化
  • 2.13.3 农杆菌的活化
  • 2.13.4 农杆菌介导的小麦转化
  • 2.14 转基因小麦的检测
  • 0植株的筛选'>2.14.1 转基因小麦T0植株的筛选
  • 1植株的检测'>2.14.2 转基因小麦T1植株的检测
  • 2.15 培养基的配制
  • 第三章 结果与分析
  • 3.1 HvABA8' OH-1基因的互补实验
  • 3.1.1 载体构建
  • 3.1.1.1 AtCYP707A2基因启动子的克隆
  • 3.1.1.2 HvABA8'OH-1基因全长cDNA的扩增与克隆
  • 3.1.1.3 GUS基因的扩增与克隆
  • 3.1.2 拟南芥的转化及分析
  • 3.1.2.1 A2pro-OH1转基因拟南芥及萌发率分析
  • 3.1.2.2 A2-pro-GUS转基因拟南芥及表达组织分析
  • 3.2 HvABA8'OH-1基因RNAi载体的构建
  • 3.2.1 大麦种子Total RNA的提取
  • 3.2.2 pGlub启动子,Nos终止子,内含子的PCR扩增
  • 3.2.3 大麦HvABA8'OH-1基因保守序列和特异序列的选取
  • 3.2.4 大麦HvABA8'OH-1基因保守序列和特异序列的RT-PCR扩增
  • 3.2.5 HvABA8'OH-1基因RNAi载体的构建及验证
  • 3.3 农杆菌介导的小麦茎端转化及转基因小麦的鉴定
  • 3.3.1 RNAi载体转化农杆菌
  • 3.3.2 小麦茎尖生长点转化及其鉴定
  • 第四章 讨论
  • 4.1 HvABA8'OH-1基因的功能验证
  • 4.2 AtCYP707A2基因启动子的组织表达特性
  • 4.3 提高小麦穗发芽抗性的途径
  • 4.4 小麦转化外植体的选择以及转化中存在的问题
  • 小结
  • 参考文献
  • 附录 攻读学位期间发表的学术论文
  • 图版说明
  • 致谢

    • 相关论文文献

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