论文摘要
研究背景和目的CI（calcineurin inhibitors,钙调磷酸酶抑制剂）是一种临床常用的免疫抑制剂,作用机理主要是抑制T细胞增殖活化,其外用制剂TCI（topical calcineurin inhibitors,外用钙调磷酸酶抑制剂）包括吡美莫司霜和他克莫司（FK506）软膏,是目前国际皮肤科领域治疗AD（atopic dermatitis,特应性皮炎）的热点药物。表皮LC（Langerhans cells,朗格汉斯细胞）是皮肤中的抗原递呈细胞,主要功能是免疫监视和启动免疫反应,表达CD1a和Langerin。表皮LC摄取了表皮中的异常抗原后,在各种细胞因子、分子的作用下发生形态的变化,外形变圆,脱离表皮迁移进入真皮,逐渐向局部引流淋巴结移行。LC在迁移过程中逐渐成熟,到达引流淋巴结后,LC刺激T淋巴细胞诱导进一步的免疫反应。当LC获得功能成熟后表达HLA-DR和共刺激分子CD83和CD86。Martires等报道吡美莫司对低剂量UV短期辐射后的人表皮LC的影响是轻微的,主要表现在与单纯UV辐射相比较有更多的HLA-DR阳性和CD83阳性LC。我们在前期小样本实验中观察到高剂量UVB一次辐射可以引起人表皮CD1a阳性LC减少,但UVB辐射联合外用吡美莫司的表皮CD1a阳性LC却有增加。K?lgen等发现大剂量UVB一次辐射能诱导表皮LC减少,其机制和凋亡及迁移有关,尤其是迁移。表皮LC迁移至真皮这一过程有众多细胞因子、粘附分子及趋化因子参与作用,主要与TNF（tumor necrosis factor,肿瘤坏死因子）-α、IL（interleukin,白细胞介素）-1β及E-cadherin等有关。TNF-α、IL-1β水平升高,E-cadherin水平降低均能促进表皮LC迁移。为此我们提出假说:外用吡美莫司能否对抗高剂量UVB辐射引起的表皮LC减少?其机制是否因为吡美莫司抑制了高剂量UVB辐射后表皮LC的迁移?为了验证这一假说,我们采用免疫组化、流式细胞术、RT-PCR（reverse transcription PCR,逆转录PCR）、Western blot（蛋白质印迹法）等多种手段探讨外用吡美莫司对高剂量UVB辐射后表皮LC的影响及其可能的分子机制。方法1.免疫组化:以40例人新鲜包皮组织为研究对象,分四组:对照组、单纯外用吡美莫司组、180 m J/cm2 UVB一次辐射组、UVB+吡美莫司组。每例组织分为4份对应4个时间点,在培养后的0h、18h、24h和48h分别收集组织块。组织取一部分用CD1a、Langerin和HLA-DR抗体分别进行免疫组化染色。计算5个高倍镜下的表皮阳性细胞总数。2.流式细胞术:分别收集各组、各时间点的组织培养液;用流式细胞术检测培养液中CD1a阳性细胞的比例。3.RT-PCR及Western blot:对收集的各组、各时间点的组织取部分进行RT-PCR检测迁移相关细胞因子及分子（TNF-α、IL-1β及E-cadherin）的m RNA（messenger ribonucleic acid,信使核糖核酸）表达水平;对有显著变化的相关因子和分子用Western blot进行蛋白质水平的验证。结果1.外用吡美莫司对高剂量UVB辐射后表皮LC数量的影响表皮CD1a阳性LC:在对照组和单纯吡美莫司组,各时间点的表皮CD1a阳性LC数量无明显差异;单纯UVB辐射组,第18h、24h、48h分别与0h比较,CD1a阳性LC数量均明显减少;在UVB+吡美莫司组,第18h、24h和48h的CD1a阳性LC数量与单纯UVB辐射组比较显著增加。表皮Langerin阳性LC:结果与CD1a阳性LC类似。表皮HLA-DR阳性LC:在对照组、单纯吡美莫司组和UVB+吡美莫司组,不同时间点HLA-DR阳性LC数量没有明显差异。在单纯UVB辐射组,HLA-DR阳性LC在18h、24h和48h的数量较0h有轻微但不显著的减少。2.外用吡美莫司对高剂量UVB辐射后表皮LC迁移的影响在0h各组未检测到细胞。从18h到48h,各组培养液的CD1a阳性细胞比例均呈显著递增趋势;对照组与单纯外用吡美莫司组相比较,在18h、24h和48h培养液中CD1a阳性细胞比例无明显差异;在18h、24h和48h,对照组培养液中CD1a阳性细胞比例均显著低于同时间点的单纯UVB组及UVB+吡美莫司组,单纯UVB组培养液中CD1a阳性细胞比例均显著高于同时间点的UVB+吡美莫司组。3.外用吡美莫司对高剂量UVB辐射后LC迁移相关因子、分子的影响RT-PCR:单纯UVB辐射组的TNF-αm RNA相对表达量从0h到48h呈不断递增的趋势。对照组和单纯UVB辐射组比较,在18h、24h和48h,后者的TNF-αm RNA相对表达量均显著高于前者。UVB+吡美莫司组的m RNA相对表达量在0h、18h、24h和48h亦呈逐渐增高的趋势,与单纯UVB辐射组相比较,在18h、24h和48h,前者的TNF-αm RNA相对表达量显著低于后者。单纯UVB辐射组和UVB+吡美莫司组的IL-1βm RNA相对表达量从0h到48h都呈不断递增的趋势。单纯UVB辐射组与对照组相比较,在18h、24h和48h,前者的IL-1βm RNA相对表达量均显著高于后者,与UVB+吡美莫司组相比较,两者无显著差异。单纯UVB辐射组和UVB+吡美莫司组的E-cadherin m RNA相对表达量从0h到48h都呈不断减少的趋势。单纯UVB辐射组和对照组相比较,在18h、24h和48h,前者的E-cadherin m RNA相对表达量均显著低于后者。UVB+吡美莫司组与单纯UVB辐射组相比较,在18h两者E-cadherin m RNA相对表达量无显著差异,在24h和48h,UVB+吡美莫司组的E-cadherin m RNA相对表达量均高于单纯UVB辐射组。Western blot:单纯UVB辐射组和UVB+吡美莫司组的TNF-α蛋白相对表达量从0h到48h都呈不断递增的趋势。对照组和单纯UVB辐射组比较,在18h、24h和48h,后者的TNF-α蛋白相对表达量均显著高于前者。UVB+吡美莫司组与单纯UVB辐射组相比较,在18h、24h和48h,前者的TNF-α蛋白相对表达量显著低于后者。单纯UVB辐射组和UVB+吡美莫司组的E-cadherin蛋白相对表达量从0h到48h都呈递减的趋势。对照组和单纯UVB辐射组比较,在18h、24h和48h,后者的E-cadherin蛋白相对表达量均显著低于前者。UVB+吡美莫司组与单纯UVB辐射组相比较,在18h、24h和48h,前者的E-cadherin蛋白相对表达量均高于后者。结论我们的研究发现高剂量UVB一次辐射可以引起人表皮LC明显减少,外用吡美莫司可以对抗高剂量UVB辐射引起的表皮LC减少,其机制可能是通过抑制高剂量UVB辐射引起的TNF-α表达增高和E-cadherin表达降低,进而抑制表皮LC的迁移。