膀胱移行细胞癌潜在生物标记物探索 ——1.膀胱移行细胞癌p16基因甲基化研究 2.膀胱移行细胞癌差异表达microRNA研究

论文摘要

膀胱癌是国人泌尿系统中最常见的肿瘤,其中超过90%为移行细胞癌。目前,膀胱移行细胞癌诊断主要依赖于膀胱镜检结合病理学检查。然而膀胱镜检为有创检查,而且组织病理学对膀胱移行细胞癌进行的分期或分级难于早期地准确预测大多数膀胱移行细胞癌的预后情况。因此寻找新的生物标记物以用于膀胱移行细胞癌的早期诊断、监测复发和判断预后已成为一个研究热点问题。近年来研究表明,肿瘤中常出现表观遗传性状改变和微小核糖核酸（microRNA,miRNA）表达异常,它们成为肿瘤诊断、治疗有效的潜在靶点,但目前在膀胱移行细胞癌中的研究尚处于探索阶段。为此,本论文对膀胱移行细胞癌表观遗传性状的改变以及microRNA差异表达两方面内容进行探讨,期以寻找诊断与治疗膀胱肿瘤新的靶点。表观遗传修饰改变是指基因表达或蛋白表达发生改变而基因型未发生变化,同时又可以通过细胞分裂和增殖而稳定遗传的现象,主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰等,其中DNA甲基化是目前研究得最清楚,也是最重要的表观遗传修饰形式。研究表明,许多膀胱移行细胞癌中出现抑癌基因DNA启动子区发生超甲基化,从而导致抑癌基因表达沉默,导致肿瘤发生。这些DNA甲基化修饰的改变为膀胱移行细胞癌诊断提供潜在靶标。p16基因是一重要的抑癌基因,近来研究结果也表明一些膀胱移行细胞癌中p16基因启动子区发生高甲基化,提示p16基因表观遗传改变可能是膀胱移行细胞癌发生发展的重要原因之一,但目前尚缺乏对国人膀胱移行细胞癌患者p16基因甲基化系统性的研究。为此,本论文第一部分采用甲基化特异性的PCR法系统检测了35例膀胱移行细胞癌癌组织及与其相匹配的尿液标本中p16基因启动子区5’CpG岛的甲基化状态,探讨国人膀胱移行细胞癌患者中p16基因甲基化情况,并探讨尿液细胞沉渣标本中p16基因甲基化在膀胱移行细胞癌诊断,尤其是非浸润性膀胱癌早期诊断中的临床意义。最近研究发现microRNA在肿瘤发生发展中发挥重要作用。microRNA通过不完全匹配的方式与mRNA结合,使目的mRNA降解或抑制目标mRNA的翻译,从而实现在转录后水平抑制靶基因表达。研究报道许多肿瘤组织/细胞中单个microRNA或microRNA表达谱发生显著改变,这些micmRNA很可能成为肿瘤诊断、治疗极具潜力的新的靶点。明确膀胱移行细胞癌中特异表达的microRNA或microRNA谱并揭示差异表达的microRNA的生物学功能将有助于对膀胱移行细胞癌发病机制的认识,并可能为膀胱移行细胞癌诊断提供新的生物标记物,然而目前microRNA在膀胱移行细胞癌中表达情况及其在膀胱移行细胞癌发生发展中的作用研究尚处于探索阶段。为此,本论文第二部分选择7例处于不同分期、分级的膀胱移行细胞癌患者的癌组织,分别以自身健康膀胱组织为对照,利用microRNA芯片的方法系统研究了膀胱移行细胞癌组织差异表达的microRNA。第一部分:膀胱移行细胞癌p16基因甲基化研究为探讨p16基因甲基化在膀胱移行细胞癌发生中意义,我们取35例膀胱移行细胞癌患者癌组织,采用甲基化特异性PCR方法检测p16基因启动子区甲基化状态,实验中采用其中9例的对侧正常膀胱黏膜组织作对照;为探讨尿液细胞沉渣标本中p16基因甲基化在膀胱移行细胞癌早期诊断中的临床意义,本论文同时检测了35例膀胱移行细胞癌患者配对尿液标本中p16基因甲基化情况,实验以正常人和非尿路肿瘤患者尿液标本为对照。结果表明,35例肿瘤组织标本,18例标本p16基因存在甲基化状态,占51.4%（18/35）,而9例对照正常膀胱组织中均未发现p16基因甲基化。35例肿瘤患者尿液标本中16例标本p16基因存在甲基化状态,占45.7%（16/35）,而正常人和非尿路肿瘤患者尿液中未检测到p16基因甲基化。Logistic回归分析显示年龄、性别、是否吸烟、合并其他疾病、肿瘤的临床分期和病理分型等因素对p16基因甲基化无影响（P＞0.05）。35例膀胱移行细胞癌患者中20例为非浸润性膀胱移行细胞癌患者,其中10例尿液标本中发现p16基因甲基化,占50.0%（10/20）,这10例患者癌组织中均检出p16基因甲基化。尿液p16基因甲基化在非浸润性膀胱移行细胞癌中的阳性预测值和特异度均为100%,假阳性为0%。非浸润性膀胱移行细胞癌组与正常人组和非尿路肿瘤组尿液中p16基因甲基化比较差异有统计学意义（P＜0.001）。以上结果提示,膀胱移行细胞癌p16基因甲基化与年龄、性别、肿瘤的分级分期无相关性;尿液p16基因异常甲基化可作为非浸润性膀胱移行细胞癌早期诊断的生物学标记物。第二部分:膀胱移行细胞癌差异表达microRNA研究为探索膀胱移行细胞癌差异表达microRNA隋况,我们利用microRNA芯片检测了7例膀胱移行细胞癌患者癌组织和自身健康膀胱组织microRNA的表达水平。研究发现,在检测的464个microRNA中,与自身正常膀胱组织相比,7位膀胱移行细胞癌患者癌组织分别有40至111个microRNA表达发生大于1.5倍的变化,其中分别有18至50个表达上调,9至89个表达下调。本研究中所用的癌组织根据肿瘤分期分为T1和T2两组。T1组共3个病例,病理分级分别为1级、1级、1-2级,3个病例癌组织有9个microRNA（miR-129、miR-141、miR-494、miR-498、miR-500、miR-513和3个未命名的microRNA）表达均发生大于1.5倍程度的上调,同时有13个microRNA（miR-let-7a、7b、7c、7d、miR-143、miR-199a*、miR-21、miR-24、miR-26a、miR-29c、miR-30a-5p、miR-30c和miR-30e-5p）的表达水平发生大于1.5倍程度的下调。表达上调的microRNA中,除了miR-141上调大于5倍外,其它microRNA平均上调2倍。表达下调的microRNA中,除miR-143下调6倍外,其它microRNA平均下调2-3倍。T2组共4个病例,病理分级分别为1级、1-2级、2级和3级。T2组中每个病例的癌组织与健康组织microRNA表达水平相比,没有统一表达上调的,但有4个microRNA（miR-26a、miR-29c、miR-30c和miR-30e-5p）在每个病例中表达下调均大于1.5倍,上述四个在T2组中表达下调的microRNA在T1组中表达也下调。总之,上述4个microRNA在7例患者膀胱移行细胞癌组织中的表达水平较正常组织表达下调。需要指出的是,T2组中3级癌症患者癌组织的microRNA表型单一,其microRNA表达变化与另外6例患者显著不同。该患者膀胱移行细胞癌组织中下调的microRNA比其他患者少,而且特定的表达上调的micmRNA与其他患者不同。有一组micmRNA表达升高,其中miRNA-21表达水平升高近10倍,而miRNA-21在其他患者癌组织中的表达并未发生显著变化。miR-let-7家族（hsa-let-7a,hsa-let-7c和hsa-let-7d）在该膀胱移行细胞癌患者癌组织中表达水平显著升高（分别升高2.07倍、1.71倍和4.20倍）,而在其他患者癌组织中表达普遍降低。为验证本次miRNA芯片试验的可信度,本论文利用定量PCR的方法检测了miR-let-7a、miR-30c和miR-129三条microRNA在7例膀胱移行细胞癌组织中与自身正常膀胱组织差异表达情况。结果表明,定量PCR结果与芯片结果相比,虽然变化倍数不同,但变化趋势一致,表明本次miRNA芯片结果可信。基于以上研究结果,小结如下:1.本研究发现,膀胱移行细胞癌患者癌组织中抑癌基因p16基因启动子区高甲基化达51.4%,导致了p16基因转录沉默、推测由此引致膀胱癌的发生。研究结果还表明,抑癌基因p16的高甲基化与患者年龄、性别、肿瘤的分级分期无相关性。2.本研究还发现,在非浸润性膀胱移行细胞癌患者中,尿液p16基因启动子区有50%出现高甲基化,提示这种检测方法经进一步完善,有可能作为非浸润性膀胱移行细胞癌早期诊断的生物标记物。3.本研究发现,在3例T1期膀胱移行细胞癌患者中,其癌组织均有13个miRNA（miR-let-7a、7b、7c、7d、miR-143、miR-199a*、miR-21、miR-24、miR-26a、miR-29c、miR-30a-5p、miR-30c和miR-30e-5p）的表达水平下调,同时有9个miRNA（miR-129、miR-141、miR-494、miR-498、miR-500、miR-513和3个未命名的miRNA）共同表达上调,而在4例T2期膀胱移行细胞癌患者中,其癌组织中有4个miRNA（miR-26a、miR-29c、miR-30c和miR-30e-5p）共同表达下调,但没有任何1例miRNA共同表达上调,此结果表明:①miR-26a、miR-29c、miR-30c和miR-30e-5p四个micmRNA在所有检测的患者的癌组织标本中均表达下调,表明这四个miRNA的下调在膀胱移行细胞癌的发生中扮演重要角色;②上述四个miRNA的下调,若同時合并有上述9个miRNA（miR-129、miR-141、miR-494、miR-498、miR-500、miR-513和3个未命名的miRNA）的共同表达上调,意味着膀胱移行细胞癌尚属早期。随着进一步扩大病例,miRNA的检测有望成为膀胱移行细胞癌诊断,分型及治疗的良好靶点。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词表
• 目次
• 1 引言
• 2 主要仪器设备、材料与试剂
• 2.1 主要仪器设备
• 2.2 主要耗材
• 2.3 主要试剂
• 3 第一部分:膀胱移行细胞癌p16基因甲基化研究
• 3.1 前言
• 3.2 技术路线
• 3.3 实验方法
• 3.4 实验结果
• 3.5 讨论
• 4 第二部分:膀胱移行细胞癌差异表达microRNA研究
• 4.1 前言
• 4.2 技术路线
• 4.3 实验方法
• 4.4 实验结果
• 4.5 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 综述一
• 综述二
• 作者在读期间所取得的科研成果