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草菇冷诱导相关基因的克隆及分析

2020-11-23阅读(849)

草菇冷诱导相关基因的克隆及分析

论文摘要

草菇（Volvariella volvacea）是一种高温型食用菌，具有较高的营养价值和保健价值，在我国已有悠久的栽培历史。同大多数热带和亚热带作物一样，草菇不耐低温冷藏，在常规低温冷藏条件下（4℃），其菌丝会发生自溶死亡，子实体亦会发软、液化，这一特性严重限制了草菇的生产、新鲜草菇的流通、低温冷藏保鲜和出口创汇以及草菇菌种的低温保藏，制约了草菇在中国甚至在世界的发展。目前草菇低温自溶的根本原因及其作用机制还难以阐释清楚。本研究利用分子生物学手段，对草菇在低温条件下基因表达的变化进行探索。首先，本实验通过RACE的方法克隆了草菇的gpd基因，从转录水平上探讨了草菇gpd基因在低温条件下的表达量情况，以期了解gpd基因与草菇低温应答的关系，建立了以gpd为内标基因检测草菇冷诱导相关基因在低温条件下转录水平的半定量RT-PCR方法。其次，利用SMARTTM cDNA文库构建试剂盒构建了草菇低温全长cDNA文库，采用本实验室已经分离到的草菇低温诱导基因片断为探针筛选cDNA文库，得到低温相关的全长基因，并克隆其上游调控序列，在基因水平上探讨低温诱导相关基因在草菇低温代谢途径中所起的作用，从而为了解草菇低温应答的分子机理提供依据，为进一步利用基因工程技术培育草菇新品种、进行草菇低温保鲜和保藏奠定了理论基础。 1 草菇gPd基因的克隆 根据已发表文献中扩增gpd片断的简并引物，以草菇基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得大小为685bp的草菇gpd的基因片断。根据这一特异性片断，设计专一引物，与RACE试剂盒中的接头引物结合，扩增得到gpd基因的5’和3’端序列，再根据5’和3’端序列设计引物，扩增得到草菇gpd基因的全长cDNA序列，该序列全长为1155bp，编码337个氨基酸残基。 根据全长cDNA序列设计引物，扩增草菇基因组DNA，得到草菇gpd的全长基因组序列，该序列全长为1635bp，基因由10个外显子和9个内含子组成。它们的长度分别为3bp（extron1）、59bp（intron1）、23（extron2）、64（intron2）、5（extron3）、47（intron3）、70（extron4）、50（intron4）、25（extron5）、59（intron5）、168（extron6）、54（intron6）、23（extron7）、48（intron7）、118（extron8）、51（intron8）、248（extron9）、

论文目录

  • 原创性声明
  • 学位论文版权使用授权书
  • 目录
  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 名词缩写
  • 文献综述
  • 1 草菇概况
  • 1.1 草菇的分类地位
  • 1.2 草菇的形态和生活史
  • 1.3 草菇的价值
  • 1.4 草菇生长的环境条件
  • 1.5 草菇产后生理和保鲜
  • 2 生物的低温胁迫生理应答研究进展
  • 2.1 植物的低温胁迫应答
  • 2.2 植物抗寒生理及其分子基础
  • 2.3 草菇低温胁迫下的生理变化研究进展
  • 3 全长基因克隆方法的研究进展
  • 3.1 EST查询法
  • 3.2 RACE技术
  • 3.3 标记探针筛选cDNA文库
  • 4 mRNA检测方法的研究进展
  • 4.1 Northern杂交法
  • 4.2 原位杂交
  • 4.3 RT-PCR定量法
  • 5 本研究的目标、内容和技术路线
  • 材料与方法
  • 1 试验材料
  • 2 试验培养基
  • 3 菌种培养及保存
  • 4 试验试剂
  • 5 草菇菌丝的培养和处理
  • 6 草菇基因组DNA的提取
  • 7 草菇gpd基因片断的PCR扩增
  • 8 草菇gpd基因片断的回收、纯化
  • 9 草菇gpd基因片断的连接
  • 10 草菇gpd基因片断的转化
  • 11 阳性质粒的提取
  • 12 阳性质粒的酶切鉴定
  • 13 鉴定正确的阳性克隆测序
  • 14 草菇gpd基因cDNA全长的获得
  • 15 gpd全长基因的扩增
  • 16 gpd基因上游序列的扩增
  • 17 Southern杂交
  • 18 Northern杂交
  • 19 杂交信号检测
  • 20 草菇低温cDNA文库的构建
  • 21 草菇低温诱导相关基因的分离
  • 22 阳性克隆的半定量RT-PCR检测
  • 23 cor3基因的原核表达
  • 24 目的蛋白的分离纯化
  • 25 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
  • 26 等电聚焦凝胶电泳
  • 27 SAHH酶活性的测定
  • 28 sahh全长基因的扩增
  • 29 sahh基因上游序列的扩增
  • 30 sahh基因的表达分析
  • 结果与分析
  • 1 草菇gpd基因cDNA全长的克隆及分析
  • 2 草菇gpd基因组全长序列的克隆及序列分析
  • 3 gpd基因上游序列的扩增
  • 4 Southern杂交分析
  • 5 Northern杂交分析
  • 6 草菇低温全长cDNA文库的构建
  • 7 草菇冷诱导相关基因的分离
  • 8 cor3基因原核表达载体的构建
  • 9 目的蛋白的分离与纯化草菇
  • 10 SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度
  • 11 目的蛋白等电点的测定
  • 12 目的蛋白酶活性的测定
  • 13 草菇sahh基因全长序列的获得
  • 14 草菇sahh基因的上游序列的扩增
  • 15 草菇sahh基因的表达分析
  • 讨论
  • 1 Northern杂交与半定量RT-PCR方法的比较
  • 2 草菇gpd基因在草菇低温应答研究中的内标作用
  • 3 草菇sahh基因与低温应答的关系
  • 4 草菇sahh基因与细胞凋亡的关系
  • 5 低温诱导相关基因功能研究的途径
  • 6 内源启动子的克隆为构建草菇表达载体提供元件
  • 全文总结
  • 参考文献
  • 附录
  • 发表文章
  • 致谢

    • 相关论文文献

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    • [28].种草菇[J]. 诗刊 2011(03)
    • [29].草菇麦草栽培新技术[J]. 农家致富 2011(15)
    • [30].草菇的营养价值及设施栽培技术[J]. 中国果菜 2018(12)

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