论文摘要
耐辐射球菌（Deinococcus radiodurans，简称DR）是地球上辐射抗性最强的生物之一，它以对电离辐射和干燥等表现强耐受力而著称。已有研究显示，DR菌极端生存能力是其保护、耐受和修复三方面协同作用的结果，而高效的抗氧化机制和DNA损伤修复是当前研究热点。最新研究认为，电离辐射产生的DNA损伤约80％由辐射水解产生的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）攻击而间接导致，这表明抗氧化损伤保护机制在DR菌中可能扮演重要角色。因此，鉴定和研究DR菌中高效抗氧化物质，对阐明抗氧化保护机制在DR菌中的贡献及解释其极端抗性机制具有重要意义。类胡萝卜素能高效猝灭单线态氧（1O2），并清除多种ROS对生物体造成的伤害。DR菌体内大量合成以deinoxanthin为主要产物的类胡萝卜素，但至今尚缺乏对它们在DR菌中的功能及其代谢的分子机理进行深入的研究。本文主要对deinoxanthin等类胡萝卜素功能及其合成酶CrtI进行鉴定和分析。研究结果如下：1．以高效液相色谱（HPLC）和薄层层析（TLC）方法分离获得高纯度deinoxanthin色素。化学发光法和体外Fenton反应分析deinoxanthin抗氧化能力，结果表明deinoxanthin具有比lycopene和β-carotene更高效的1O2和H2O2清除能力，能有效保护质粒DNA并降低其氧化损伤程度。2．生物信息学方法筛选基因组获得控制deinoxanthin合成的关键蛋白DR0861，蛋白N-端和C-端分别具有保守βαβ折叠Motif和八氢番茄红素脱氢酶（PDS）信号序列。DR0861全基因敲除和N-端功能域（19-69aa）缺失均导致红色DR菌变为无色菌株，HPLC显示DR菌deinoxanthin等类胡萝卜素随DR0861突变而消失，而欧文氏菌（E.uredovora）crtI基因补偿可以使无色突变株恢复颜色。表明DR0861基因参与了DR菌中deinoxanthin的代谢路径，具有催化合成有色类胡萝卜素功能。DR0861缺失影响突变株对γ射线和H2O2抗性，导致细胞提取物对1O2和H2O2清除能力降低。表明DR0861蛋白催化合成的类胡萝卜素参与了DR菌体内的抗氧化保护体系，可能对其极端抗性机制有重要贡献。3．大肠杆菌（E.coli）过表达和纯化获得DR0861蛋白，体内和体外生化反应产物HPLC分析显示，DR0861能通过多步脱氢反应，催化无色八氢番茄红素（phytoene）底物生成红色的番茄红素（lycopene）产物，表明DR菌DR0861基因编码CrtI类型而非CrtP／Q型PDS。通过对E.coli色素工程菌研究还发现，lycopene等类胡萝卜素的生成可使E.coli产生浅红色，并明显提高E.coli对低剂量电离辐射和H2O2抗性。除研究非酶类抗氧化物（类胡萝卜素）之外，我们还对DR菌抗氧化体系重要组成部分——抗氧化功能蛋白Dps-2进行鉴定和研究。Dps-2（DRB0092）序列含多个赖氨酸保守位点，其N-端前沿包含一段特殊信号肽序列，C-端存在保守亚铁氧化酶（ferroxidase）功能域。dps-2全基因缺失导致DR菌生长受到明显影响，而且细胞对电离辐射、紫外线、干燥和H2O2等均表现敏感，并导致蛋白提取物对自由基清除能力降低。E.coli表达和纯化分别获得Dps-2完整蛋白WDps、N-端信号肽突变蛋白N30Dps和C-端ferroxidase突变蛋白C20Dps。SDS-PAGE结果表明，三种蛋白均能形成多聚体，但产生高聚体的比例受盐离子浓度等影响；信号肽突变提高N30Dps对不同温度（37-60℃）的热稳定性，而C-端结构域缺失导致C20Dps蛋白活性对温度异常敏感。Native-PAGE活性染色和亚铁氧化动力学结果表明，WDps和N30Dps蛋白具有催化Fe2+生成Fe3+功能，而C20Dps亚铁氧化酶活性完全丧失。体外DNA结合和Fenton反应结果显示，突变蛋白C20Dps不具有DNA结合功能，不能保护DNA免受自由基攻击；而N30Dps具有结合DNA的能力，它和WDps均能降低Fenton反应自由基攻击导致的DNA氧化损伤。综上所述，耐辐射球菌DR0861基因编码CrtI类型PDS，它以phytoene为底物，在DR菌体内参与催化合成deinoxanthin。抗氧化保护蛋白Dps-2具有亚铁氧化酶活性和非特异DNA结合等功能，催化毒性Fe2+生成无害Fe3+并能结合生成的Fe3+，降低细胞内环境毒性，并与染色体形成致密Dps-DNA复合体，保护DNA降低自由基损伤程度，它与类胡萝卜素等物质共同参与了DR菌体内抗氧化体系，对该菌的极端抗性机制具有重要贡献。