锰超氧化物歧化酶基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的辐射保护作用初步研究

论文摘要

锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase,MnSOD）是生物体细胞的重要抗氧化酶之一。其通过非细胞毒性机制抑制肿瘤生长,也能清除电离辐射诱导产生的超氧阴离子自由基（O-2·）,被学者认为是很有应用前景的抑癌基因和抗辐射基因。骨髓间充质干细胞（mesenchymalstem cells,MSCS）具有多向分化的可塑性,体外培养贴壁生长,易于采集和分离扩增,连续传代不易丢失其干细胞特性,有向骨髓归巢的特点,回输体内后可定位于骨髓并通过自我更新而长期存活,可在体内、外表达多种治疗性的外源目的基因而不明显影响其干细胞特性,植入反应较弱。因此,骨髓MSCS被认为是一种理想的基因治疗靶细胞。本文从人肝癌细胞株HuH-7中提取mRNA,采用半巢式PCR方法扩增人MnSOD cDNA,将克隆的基因片段插入载体pMD18-T内的XhoⅠ/XbaⅠ位点,酶切分析和序列测定正确后,经XhoⅠ、XbaⅠ双酶切T4连接酶连接,构建真核表达载体pEGFP-MnSOD;脂质体介导将pEGFP-MnSOD质粒转入体外培养的大鼠骨髓MSCS,通过绿色荧光细胞计数计算转染效率,RT-PCR检测目的基因表达,G418筛选目的基因转染克隆;对转染细胞以不同剂量x线照射,通过MnSOD活性、细胞存活率及DNA凝胶电泳分析,探讨MnSOD基因转染对骨髓MSCS的辐射保护作用。结果显示:凝胶电泳、序列测定证实MnSOD基因扩增正确,真核表达载体pEGFP-MnSOD构建成功;荧光显微镜观察和RT-PCR证实MnSOD基因成功转入体外分离培养的骨髓MSCS;MnSOD活性、细胞存活率及凝胶电泳特异性条带分析初步证实MnSOD基因转染对大鼠骨髓MSCS有辐射保护作用,为MnSOD转基因的基础和应用研究奠定了一定的实验基础。

论文目录

• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 文献回顾
• 1. 锰超氧化物歧化酶研究进展
• 2. 骨髓间充质干细胞研究进展
• 第二部分 MnSOD 基因的克隆及真核表达载体的构建
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 第三部分 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 第四部分 MnSOD 基因转染骨髓间充质干细胞的体外辐射保护作用
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 个人简历及攻博期间发表的学术论文
• 中文摘要
• Abstract
• 致谢