重组人内抑素对佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞周期的影响及机制研究

论文摘要

目的观察重组人内抑素（recombinant human endostatin, rh-Endostatin）对佐剂性关节炎（adjuvant arthritis,AA）大鼠成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes, FLS）周期及其相关基因表达的影响,探讨其抑制AA FLS增殖的细胞与分子机制,为类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）药物治疗及寻找治疗新靶点提供实验依据。方法①AA大鼠模型的制备:雄性SD大鼠,6-7周龄,体重160-170g,后足跖皮内注射弗氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant, CFA）0.1ml致炎。②动物分组及给药:造模后d10,将AA诱导的大鼠分为AA组、rh-Endostatin组和甲氨蝶呤（methotrexate, MTX）组,其中rh-Endostatin组于造模后d 10开始,连续7d腹部皮下注射给药（2.5mg·kg-1·d-1）,MTX组于造模后d10和d16腹部皮下注射给药（1.0mg·kg-1·d-1）,d26处死大鼠用于后继实验。③实时荧光定量PCR（RT-FQ-PCR）检测各组大鼠滑膜组织中周期相关基因p53、p21、周期蛋白依赖性激酶-4（cyclin-dependent kinase 4, CDK4）、细胞周期素D1（CyclinD1）和增殖细胞核抗原（preliferation cell nuclear antigen, PCNA）mRNA的表达。④Western blot法检测各组大鼠滑膜组织中PCNA和CyclinD1蛋白的表达。⑤组织块移植法培养细胞及鉴定FLS:取正常组和AA组大鼠滑膜组织作细胞培养,流式细胞仪（flom cytometry,FCM）检测传2代的AA组大鼠滑膜细胞中血管细胞粘着分子（vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1）的表达。⑥FCM检测各组FLS的周期:将AA FLS均分为AA组、rh-Endostatin（50μg·ml-1）组和MTX（1μg·ml-1）组,加药培养48h后和正常组FLS同时上机检测。结果①大鼠致炎后d10即可出现继发性炎症反应,表现为四肢足爪肿胀,耳、尾出现炎性结节和红斑并伴有体重减轻。造模后d 26,光镜下可见其滑膜组织水肿、大量炎性细胞浸润、滑膜细胞过度增殖等。②与AA组相比,rh-Endostatin组大鼠滑膜组织中p53和p21mRNA表达水平降低,CDK4 mRNA的表达水平显著增高。rh-Endostatin组滑膜组织中CyclinD1和PCNA mRNA及其蛋白的表达量均低于AA组,以上差异均具有统计学意义（P<0.01）。③传2代培养的AA大鼠滑膜细胞经FCM鉴定,VCAM-1表达率为94.2%。④rh-Endostatin使AA FLS细胞周期G0/G1期的比例由10%上升到74.1%,S期和G2/M期分别由65.6%、19.5%下降到12.6%、4.15%。结论①传2代培养的AA大鼠滑膜细胞主要为FLS。②rh-Endostatin使AA FLS的周期停滞在G0/G1期,抑制了FLS周期的进程。③rh-Endostatin使滑膜细胞周期停滞于G0/G1期的相关机制之一是通过下调周期相关基因PCNA、CyclinD1的表达,且不依赖于p53、p21和CDK4。

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• 重组人内抑素对佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞周期的影响及机制研究
• 1. 前言
• 2. 实验材料
• 3. 实验方法
• 4. 结果
• 5. 讨论
• 6. 结论
• 7. 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述
• 参考文献