龟鹿二仙胶及其折方对大鼠软骨细胞增殖与基质合成的影响

论文摘要

目的：应用体外软骨细胞培养技术,建立软骨细胞培养体系。按单味药研究方法将龟鹿二仙胶拆分为龟板、鹿角、人参和枸杞四味拆方,对比观察龟鹿二仙胶全方及四味拆方对大鼠关节软骨细胞的作用,通过对其促进软骨细胞增殖、Ⅱ型胶原以及蛋白黏多糖合成影响的观察,从细胞、分子水平探讨龟鹿二仙胶及其拆方对软骨细胞的作用机制,阐述龟鹿二仙胶方君臣配伍关系的科学内涵,为开发高效优质的中药新药提供科学依据。方法：1.建立软骨细胞体外培养体系：采用酶消化方法分离原代软骨细胞；倒置显微镜下观察各代软骨细胞的形态学变化；MTT法描绘各代软骨细胞生长曲线,观察细胞生长特性；甲苯胺蓝染色结合Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色联合鉴定软骨细胞表型。2.MTT比色法检测龟鹿二仙胶及其拆方含药血清对软骨细胞增殖的影响,并探讨龟鹿二仙胶及其拆方含药血清在不同灌胃剂量以及不同干预时间下对软骨细胞增殖影响,筛选出各药物剂量组含药血清促进软骨细胞增殖的最佳量效以及最佳时效。3.免疫细胞化学法检测龟鹿二仙胶及其拆方含药血清对软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响。4.高碘酸希尔（Periodic Acid Schiff,PAS）染色法检测龟鹿二仙胶及其拆方含药血清对软骨细胞中性黏多糖表达的影响。5.阿尔辛蓝（Alcian Blue,AB）染色法检测龟鹿二仙胶及其拆方对软骨细胞酸性黏多糖表达的影响。6.PAS-AB法联合染色检测龟鹿二仙胶及其拆方对软骨细胞蛋白黏多糖表达的影响。结果：1.成功分离并培养4周龄SD大鼠关节软骨细胞；原代培养的软骨细胞48h后外观呈星状形、不规则形,胞浆丰富,核仁清晰。组织形态学、甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学染色以及MTT描绘生长曲线结果显示,软骨细胞培养3代以内可以良好维持表型的稳定,传4代以后开始出现去分化现象。2.MTT比色法筛选结果显示：各药物组在24h、48h、72h对软骨细胞的增殖效应均不随剂量呈比例递增趋势,其中以中剂量药物组干预软骨细胞48h促增殖药效最佳,选取作为促进软骨细胞增殖的最佳量效以及最佳时效并作为后续试验干预方案；48h时,OTL（Glucosamine hydrochloride Capsules,OTL）组和全方组均可非常显著促进软骨细胞增殖（P<0.01）,鹿角组和龟板组均可显著促进软骨细胞增殖（P<0.05）,人参组和枸杞组对软骨细胞增殖作用无统计学差异（P>0.05）；与全方组比较,OTL组有显著差异（P<0.05）；鹿角组或龟板组均具有显著差异（P<0.05）,人参组或枸杞组均具有非常显著差异（P<0.01）；各拆方组比较,鹿角组或龟板组与人参组或枸杞组比较均具有显著差异（P<0.05）,鹿角组与龟板组比较、人参组与枸杞组比较均无统计学差异（P>0.05）。3.免疫细胞化学结果显示：各组标本均可见Ⅱ型胶原表达,表达部位为胞浆,可见棕黄色颗粒或成团片状。OTL组与全方组均可非常显著促进软骨细胞Ⅱ型胶原表达（P<0.01）；鹿角组或龟板组均可显著促进软骨细胞Ⅱ型胶原表达（P<0.05）；人参组或枸杞组对促进软骨细胞Ⅱ型胶原表达无统计学差异（P>0.05）；与全方组比较,OTL组有显著差异（P<0.05）；鹿角组或龟板组均呈显著差异（P<0.05）,人参组或枸杞组均呈非常显著差异（P<0.01）；各拆方组比较,鹿角组或龟板组与人参组或枸杞组比较有显著差异（P<0.05）,鹿角组与龟板组比较、人参组与枸杞组比较均无统计学差异（P>0.05）。4.PAS法染色结果显示：各组标本均可见中性黏多糖表达,表达部位为软骨基质与细胞周围,可见紫红色颗粒或成团片状,OTL组与全方组均可非常显著促进软骨细胞中性黏多糖表达（P<0.01）；鹿角组或龟板组均可显著促进软骨细胞中性黏多糖的表达（P<0.05）；人参组或枸杞组对促进软骨细胞中性黏多糖的表达无统计学差异（P>0.05）；与全方组比较,OTL组具有显著差异（P<0.05）；鹿角组或龟板组均呈显著差异（P<0.05）,人参组或枸杞组均呈非常显著差异（P<0.01）；各拆方组比较,鹿角组或龟板组与人参组或枸杞组比较有显著差异（P<0.05）,鹿角组与龟板组比较、人参组与枸杞组比较均无统计学差异（P>0.05）。5.AB法染色结果显示：各组标本均可见酸性黏多糖表达,表达部位为细胞核与胞核周围,可见胞核呈深蓝色异染,胞核周围呈淡蓝色异染,OTL组与全方组均可非常显著促进软骨细胞酸性黏多糖表达（P<0.01）；鹿角组或龟板组均可显著促进软骨细胞酸性黏多糖的表达（P<0.05）；人参组或枸杞组对促进软骨细胞酸性黏多糖的表达无统计学差异（P>0.05）；与全方组比较,OTL组呈显著差异（P<0.05）；鹿角组或龟板组均呈显著差异（P<0.05）,人参组或枸杞组均呈非常显著差异（P<0.01）；各拆方组比较,鹿角组或龟板组与人参组或枸杞组比较有显著差异（P<0.05）,鹿角组与龟板组比较、人参组与枸杞组比较均无统计学差异（P>0.05）。结论：采用酶消化法分离培养的大鼠软骨细胞,在3代以内可良好维持细胞表型,符合软骨细胞生物学特性；龟鹿二仙胶及其拆方含药血清对软骨细胞的增殖均不随剂量以及干预时间呈比例递增趋势,以中剂量含药血清干预48h时促进软骨细胞增殖药效最佳；龟鹿二仙胶可非常显著促进软骨细胞增殖以及Ⅱ型胶原和蛋白黏多糖的合成,全方药效显著优于各拆方,与阳性对照组药物OTL具有类似药效；拆方龟板、鹿角均可有效促进软骨细胞增殖以及Ⅱ型胶原和蛋白黏多糖的合成；人参、枸杞对软骨细胞增殖以及Ⅱ型胶原和蛋白黏多糖的合成均无明显促进作用；说明龟板、鹿角是全方中发挥主要作用的药物,显示出了君药的重要地位；提示龟板和鹿角均可能含有某类可直接刺激软骨细胞增殖的有效成分,人参、枸杞通过与龟板、鹿角的优化配伍,可显著激发龟板和鹿角的药效,具有明显的协同辅助作用,其机制可能是通过各药物相互作用后促进龟板和鹿角中此类有效成分的增加,具体相互作用机制仍需进一步实验探讨。龟鹿二仙胶直接刺激软骨细胞增殖,通过细胞数目不断增多,进而促进软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白黏多糖,这可能是其延缓软骨退变,防治OA的作用机制之一。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 1 实验材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 实验药物
• 1.4 实验动物
• 2 实验方法
• 2.1 龟鹿二仙胶及其拆方药液的煎制
• 2.2 龟鹿二仙胶及其拆方含药血清的制备
• 2.3 大鼠软骨细胞的分离、培养、鉴定以及生长曲线的绘制
• 2.4 MTT法检测龟鹿二仙胶及其拆方含药血清对软骨细胞增殖的影响
• 2.5 龟鹿二仙胶及其拆方含药血清对软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响
• 2.6 龟鹿二仙胶及其拆方对软骨细胞蛋白黏多糖合成的影响
• 2.7 图像分析
• 2.8 统计学分析
• 3 实验结果
• 3.1 龟鹿二仙胶及其拆方含药血清的制备
• 3.2 倒置显微镜下观察各代软骨细胞的组织形态学变化与生长情况
• 3.3 软骨细胞表型的鉴定结果
• 3.4 各代软骨细胞生长曲线分析结果
• 3.5 各药物组促进软骨细胞增殖的最佳时效以及最佳量效的筛选结果
• 3.6 MTT比色试验检测软骨细胞增殖结果
• 3.7 免疫细胞化学法染色检测Ⅱ型胶原的表达结果
• 3.8 PAS法染色检测中性黏多糖的表达结果
• 3.9 AB法染色检测酸性黏多糖的表达结果
• 3.10 PAS-AB法联合染色检测蛋白黏多糖的表达结果
• 4 分析与讨论
• 4.1 龟鹿二仙胶方义分析
• 4.2 中药复方拆方研究的目的与意义
• 4.3 血清药理学研究意义及存在的问题
• 4.4 体外培养原代软骨细胞的方法及影响因素
• 4.5 体外培养软骨细胞与研究OA防治的意义
• 4.6 软骨细胞的生长分化与染色鉴定
• 4.7 关于MTT比色法检测的基本原理
• 4.8 MTT比色法描绘各代软骨细胞生长曲线的意义
• 4.9 促进软骨细胞增殖的最佳时效以及最佳量效含药血清的筛选
• 4.10 龟鹿二仙胶及其拆方含药血清对软骨细胞增殖的影响
• 4.11 软骨细胞Ⅱ型胶原的维持表达对OA的防治意义
• 4.12 龟鹿二仙胶及其拆方对软骨细胞合成Ⅱ型胶原的影响
• 4.13 关于PAS法与AB法染色检测的基本原理
• 4.14 软骨细胞蛋白黏多糖的合成与OA防治的关系
• 4.15 龟鹿二仙胶及其拆方对软骨细胞蛋白黏多糖合成的影响
• 5 结论
• 6 问题与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录一: 文献综述
• 参考文献
• 附录二 作者简历