葛根芩连汤药材蛋白自组装行为的研究

论文摘要

葛根芩连汤始载于东汉时期张仲景的《伤寒论》,由葛根、黄芩、黄连、甘草四味中药组成,具有解表清里之功效,主治口中作渴,胸脘烦热,身热下利等功效。对葛根芩连汤药效成分的研究多集中于单个药材的植物化学研究,如葛根素和小檗碱等,少有对汤剂多相体系,特别是胶体体系进行关联性研究。近年来,有研究表明,中药汤剂煎煮过程中出现的胶体等复合物与中药药效关系密切,这一发现为探索中药汤剂药用机理带来了新的研究思路。本课题研究以葛根芩连汤中的蛋白质为对象,考察葛根芩连汤煎煮过程中的蛋白质自组装行为。研究首先对君药葛根、臣药黄连所含主要蛋白质进行分离纯化,对获得的蛋白质进行特性表征,并着重调查了该蛋白质自组装形成颗粒的条件、蛋白质颗粒的性质、细胞毒性以及搭载小分子化合物的能力。实验获得葛根蛋白（命名为PP）、黄连蛋白（命名为CP）各一条,经过N-端测序、质谱、序列比对和活性验证后确定PP为胰蛋白酶抑制剂,CP为植物糖蛋白。对PP进行的胰蛋白酶抑制剂活性表征结果显示,该胰蛋白酶抑制剂达到100%抑制的摩尔比为1/2,具有较佳的pH和温度稳定性,于90℃时失去抑制能力,最佳活性pH为8。应用激光粒度仪对两种蛋白质在水溶液加热过程中自组装形成颗粒的现象进行了研究,并对相关影响因素进行了调查,最后确定葛根蛋白纳米颗粒形成条件为：pH 6.05、100℃、加热60 min、蛋白浓度为0.089 mg/mL,黄连蛋白纳米颗粒形成条件为：pH 7.15、80℃、加热60 min、蛋白浓度为0.109 mg/mL。对蛋白纳米颗粒细胞毒性实验和药物搭载能力的实验结果显示,葛根蛋白颗粒包埋葛根素的效率为33.8%,黄连蛋白包埋盐酸小檗碱的效率为44.2%。葛根胰蛋白酶抑制剂对L-02、Hep-G2均有抑制作用,而黄连蛋白对L-02并无影响；此外,包埋了葛根素、小檗碱的纳米颗粒均对Hep-G2细胞有抑制作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 葛根芩连汤概述
• 1.2 葛根芩连汤研究进展
• 1.2.1 葛根芩连汤药理作用的研究
• 1.2.1.1 抗菌抗病毒
• 1.2.1.2 抗炎解热
• 1.2.1.3 抗心律失常
• 1.2.1.4 降血糖抑制代谢综合征
• 1.2.2 葛根芩连汤中单味药材研究进展
• 1.2.2.1 葛根
• 1.2.2.2 黄芩
• 1.2.2.3 黄连
• 1.2.2.4 甘草
• 1.2.3 葛根芩连汤配伍规律及药效学的研究
• 1.2.3.1 中药复方配伍规律的研究
• 1.2.3.2 葛根芩连汤配伍量效关系研究
• 1.2.3.3 葛根芩连汤配伍药代动力学研究
• 1.2.3.4 葛根芩连汤不同配伍的影响
• 1.3 目前葛根芩连汤药效的研究方向
• 1.4 中药作用机制研究新方法
• 1.4.1 蛋白质纳米颗粒的自组装行为
• 1.4.2 植物中相关蛋白的研究
• 1.4.2.1 糖蛋白
• 1.4.2.2 胰蛋白酶抑制剂
• 1.4.3 中药纳米技术的优势
• 1.4.3.1 增强药物靶向作用
• 1.4.3.2 控释与缓释作用
• 1.4.3.3 提高生物利用度
• 1.4.3.4 降低药物毒副作用
• 1.5 本课题的研究目的及意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 仪器设备与材料
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 实验药材
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 层析柱填料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 样品蛋白初提液制备
• 2.2.1.1 葛根与黄连的蛋白抽提
• 2.2.1.2 葛根抽提液的乙醇沉淀
• 2.2.1.3 黄连抽提液的硫酸铵沉降
• 2.2.1.4 透析
• 2.2.2 层析法分离蛋白质
• 2.2.2.1 葛根蛋白分离纯化——High Q阴离子交换色谱
• 2.2.2.2 黄连蛋白分离纯——Sephadex G-25凝胶层析
• 2.2.3 蛋白质定量定性分析
• 2.2.3.1 蛋白质纯度鉴定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.2.3.2 蛋白质含量测定——Folin-酚法
• 2.2.3.3 蛋白质等电点测定——等电聚焦
• 2.2.3.4 测定蛋白质分子量——质谱
• 2.2.3.5 蛋白质序列测定
• 2.2.3.6 糖蛋白的鉴定——过碘酸-希夫（PAS）染色法
• 2.2.3.7 胰蛋白酶抑制剂活性测定
• 2.2.4 蛋白纳米颗粒自组装初步探索
• 2.2.4.0 测量纳米颗粒粒径分布——动态光散射技术
• 2.2.4.1 测定纳米颗粒稳定性——Zeta电位
• 2.2.4.2 pH、温度、加热时间对蛋白纳米颗粒自组装的影响
• 2.2.4.3 纳米颗粒对有效成分的包埋率——高效液相色谱（HPLC）
• 2.2.5 纳米颗粒的细胞毒性研究
• 2.2.5.1 细胞培养
• 2.2.5.2 检测细胞增殖——MTT比色法
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 葛根蛋白分离纯化
• 3.1.1 葛根蛋白粗提液制备
• 3.1.2 葛根蛋白分离纯化
• 3.2 黄连蛋白的分离纯化
• 3.2.1 黄连蛋白粗提液制备
• 3.2.2 黄连蛋白的分离纯化
• 3.2.3 小结
• 3.3 蛋白纳米颗粒自组装的初步探索
• 3.3.1 葛根蛋白自组装行为研究
• 3.3.1.1 选定最适pH范围
• 3.3.1.2 选择最适加热温度
• 3.3.1.3 选择加热时间
• 3.3.1.4 小结
• 3.3.2 黄连蛋白自组装行为研究
• 3.3.2.1 选定最适pH范围
• 3.3.2.2 选择最适温度
• 3.3.2.3 选择最适加热时间
• 3.3.2.4 小结
• 3.3.3 蛋白纳米颗粒包埋有效成分
• 3.3.3.1 纳米颗粒包埋行为的初探
• 3.3.3.2 计算包埋率
• 3.4 蛋白质定量定性分析
• 3.4.1 福林酚测蛋白含量
• 3.4.2 质谱
• 3.4.3 等电聚焦
• 3.4.4 N-末端测序
• 3.4.5 黄连糖蛋白的鉴定
• 3.4.6 葛根胰蛋白酶抑制剂活性测定
• 3.4.7 细胞毒性实验
• 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 个人简历