Notch信号通路活化在肾缺血—再灌注损伤中的作用及冬虫夏草肾保护作用机制的研究

论文摘要

研究背景：急性肾衰竭（acute renal failure,ARF）是一种常见的临床危急重症,常以氮质血症、水电解质和酸碱平衡紊乱及全身各系统并发症为主要临床表现,严重危害人类健康。近年来,尽管ARF的基础和临床研究取得了较大进展,但其发病率和死亡率仍居高不下,其主要原因是ARF发病原因错综复杂,发病机制迄今尚未明确,特别是很多ARF患者早期症状不明显,直致病情发展到一定程度才出现血清肌酐升高,让临床医生失去了适时救治的良好机会。因此,近年来学者们将急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）的概念引入肾脏病和急诊医学领域,趋向将ARF更称为急性肾损伤,这样更有利于临床医生早期诊断和治疗AKI,即在肾功能开始下降、甚至肾脏组织学有损伤、生物标志物改变而GFR尚正常的阶段将之识别并及早干预治疗,以避免ARF的发生。如何早期识别和诊断AKI,何种机制和学说能更好的解释AKI的发生发展过程已成为当今肾脏病领域研究的热点。肾缺血-再灌注损伤（Ischemia reperfusion injury, IRI）是AKI的主要发病机制之一,这已被学者们的研究证实。而凋亡和炎症在肾IRI的发生发展中起重要作用。IRI可引起肾小球内皮细胞功能障碍,继而内皮细胞表达细胞间粘附分子增多,介导血流中的有形成分如中性粒细胞、单核细胞粘附至血管内皮细胞,这些细胞都可以通过各种网络信息调控并刺激这些细胞分泌TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8等炎症因子和MCP-1等化学趋化因子,通过这些炎性因子再激活炎症的级联反应,导致肾组织炎症反应发生,最终引起AKI。肾小管上皮细胞,作为肾脏的固有细胞,在肾IRI的环境下,其本身既可以因为缺血而受到损伤,也可以在某些因子的影响下转化为炎症细胞,分泌TNF-α、IL-2、IL-6等炎症因子,参与了AKI的发生。实验研究表明,TNF-α、IL-1、IL-6等炎症因子的拮抗剂通过抑制IRI相关的炎症和肾小管上皮细胞凋亡发挥肾保护作用,提示TNF-α、IL-1、IL-6等炎症因子在AKI发生和治疗中起了十分重要的作用。资料表明,AKI发生时启动多种信号通路,Notch信号通路就是其中之一。近年来有研究证明,肾IRI时Notch信号通路被重新激活,参与肾小管上皮细胞损伤后的再生。Notch信号通路是一进化上保守的细胞间信号传导通路,参与细胞的生长、增殖、分化等过程,它不仅在肾脏发育过程中对细胞命运的决定起关键作用,而且在疾病状态下可被重新激活,通过与其他信号通路的交叉对话（across-talking）,参与凋亡、再生以及小管-间充质细胞转分化等过程,影响着多种肾脏疾病的发生和发展。而且有学者在呼吸系统和自身免疫性疾病的研究中发现,Notch信号通路通过与NF-κB信号之间的交叉对话,调节Thl和Th2反应而参与了支气管哮喘、类风湿关节炎等炎症过程。但活化的Notch信号通路是否参与调控肾IRI相关的炎症和氧化应激过程,这需要进一步研究证实。本组前期研究已证明冬虫夏草（Cordyceps Sinensis, CS）对糖尿病肾病、高血压肾损伤模型鼠具有良好的肾保护作用,CS是否可以通过影响肾IRI诱导的炎症和氧化应激发挥肾保护作用,其作用靶点是否与抑制Notch信号通路活化有关,目前国内外未见报道。本研究拟以I/R大鼠模型和抗霉素A与肾小管上皮细胞共培养模拟的体外的I/R模型为研究对象,一方面观察I/R损伤时IL-6、TNF-α、MCP-1和HIF-1α的表达状况和Notch2/hes-1信号转导通路是否被激活；另一方面用Notch信号通路关键酶（?）-secretase抑制剂和冬虫夏草进行干预实验,其目的是：1.观察肾I/R是否可上调肾小管上皮细胞IL-6、TNF-α、MCP-1和HIF-1α的表达,从而证实肾IRI存在炎症和氧化应激过程。2.观察肾I/R是否可激活Notch2/hes-1信号通路,活化的Notch2/hes-1信号通是否参与IL-6、TNF-α、MCP-1和HIF-1α的调控,证实Notch2/hes-1信号通路是否参与肾IRI相关的炎症和氧化应激过程。3.观察冬虫夏草是否通过抑制Notch2/hes-1信号通路的活化,继而影响IL-6、TNF-α、MCP-1和HIF-1α的表达,通过抗炎和抗氧化发挥肾保护作用,从而探讨冬虫夏草的作用机制和靶点。实验方法：1.60只健康雄性SD （Sprasue-Dawley）大鼠用10%水合氯醛溶液（3.5mL/kg）腹腔注射局部浸润麻醉后,从腹部正中切口,行右肾切除术,稳定10min后将大鼠随机分成假手术组（sham组）、缺血-再灌注组（I/R）、DAPT组（DAPT）、冬虫夏草（CS）组4组,每组组内再按再灌注时间分为24h、48h、72h 3个时间点。缺血-再灌注组（I/R组）大鼠持续夹闭左肾蒂60min后恢复灌注,予以生理盐水（2 mL/d）灌胃；DAPT组大鼠持续夹闭左肾蒂60min后恢复灌注,术后予以γ-泌肽酶抑制剂DAPT （500μg/100g.d）灌胃；冬虫夏草（CS）组大鼠持续夹闭左肾蒂60min后恢复灌注后,予以冬虫夏草提取液（5g/kg.d）灌胃；假手术组（sham组）大鼠切除右肾后分离左输尿管,但不夹闭左肾蒂,术后予以生理盐水（2 mL/d）灌胃,分别在上述时间点处死大鼠,处死前收集尿液和血液。检测各组大鼠肾功能（BUN、Scr）情况；ELISA法检测各组大鼠TNF-α、IL-6水平；比色法检测各组大鼠尿NAG水平,HE染色观察各组大鼠肾脏病理,并半定量评分法观察各组大鼠肾小管间质损伤；RT-PCR法检测各组大鼠Notch2、hes-1mRNA的表达；免疫激光共聚焦法和western blot法检测各组大鼠Notch2、hes-1、MCP-1、HIF-1α蛋白的表达。2.首先用MTT法观察不同浓度DAPT （0.1μmol/L, 1μmol/L, 10μmol/L, 100μmol/L）和CS提取液（10mg/L,20mg/L,40mg/L, 80mg/L）对NRK52E增殖的影响,确定DAPT工作液和CS工作液的浓度。3.将NRK-52E细胞置于低糖型完全DMEM培养基中培养,分为normal组、缺血-再灌注组（I/R组）、DAPT组和CS组4组。I/R诱导的NRK-52E细胞模型用下法建立：用不含血清的D-Hanks液+抗霉素A（10μmol/L）模拟缺血3h,恢复低糖型完全DMEM培养基模拟再灌注。normal组NRK-52E不作任何处理,正常条件培养；DAPT组NRK-52E造模前24h和再灌注时用含10μmol/L DAPT工作液处理,直至收集细胞,组内按再灌注时间分为24h、48h、72h 3个时间点；CS组（n=15）：按上述方法造模,造模前24h预先用含40mg/L的CS工作液处理,再灌注时用CS工作液培养,直至收集细胞,组内按再灌注时间分为24h、48h、73h 3个时间点。细胞免疫化学荧光法和Western blot法观察各组NRK-52E细胞Notch2、hes-1、MCP-1、HIF-1α蛋白的表达。实验结果：1.体内实验结果显示,肾I/R时大鼠体内血清BUN和Scr升高,尿中NAG排出增多,肾脏病理出现肾小管刷状缘丢失、小管上皮细胞变性坏死、部分小管扩张、管型形成,肾间质大量炎症细胞浸润等病变,提示肾I/R大鼠AKI模型建立成功。肾I/R时大鼠血清TNF-a、IL-6水平增高（P<0.01）；肾组织中Notch2、hes-1、MCP-1、HIF-1α的mRNA和/或蛋白表达上调（P<0.01）,并均于再灌注后24h达高峰。而DAPT干预能改善肾小管间质损伤,改善肾功能,降低血清INF-α、IL-6水平（P<0.05或P<0.01）,下调Notch2、hes-1、NF-κB2、MCP-1mRNA和/或蛋白表达,上调HIF-1α蛋白表达（P<0.01）,提示DAPT可选择性地阻断肾小管上皮细胞Notch2/hes-1信号通路,调控IL-6、TNF-α、MCP-1、HIF-1α等转录,有效地控制肾IRI时所诱导的炎症和氧化应激过程,具有良好的肾保护作用。2.体内实验结果显示,CS干预后可改善I/R大鼠肾小管间质损伤,改善其肾功能,同时降低血清TNF-α、IL-6及尿NAG水平（P<0.01）,下调Notch2/hes-1、MCP-1mRNA和/或蛋白表达（P<0.01）,上调HIF-1α蛋白表达（P<0.01）,提示CS对I/R时的肾保护作用可能是通过抑制Notch信号通路活化,调控IL-6、TNF-α、MCP-1 HIF-1等基因转录而实现的。3.MTT结果显示,与对照组OD值相比较,浓度为0.1～10μmol/L DAPT组和浓度为10-40mg/LCS组NRK52E的OD值差异无统计学意义（P>0.05）；溶度为100μmo1/L的DAPT和80mg/L的CS均能显著抑制NRK-52E的增值（P<0.01）。因此,我们在下面的实验选择DAPT和CS的处理溶度为10μmol/L和40mg/L。4.体外实验结果显示,细胞免疫化学荧光法和western blot结果显示,I/R可诱导NRK-52E的Notch2、hes-1、MCP-1、HIF-1α蛋白表达上调,且Notch2、hes-1、MCP-1和HIF-1α蛋白表达均于再灌注后24h达高峰。然而,DAPT干预可下调Notch2、hes-1、MCP-1蛋白表达（P<0.01）,上调HIF-1α蛋白（P<0.01）,结果表明I/R能诱导NRK-52E的Notch2/hes-1信号通路活化,从而调控MCP-1和HIF-la的转录。5.体外研究结果显示,经CS （40mg/L）干预后,肾小管上皮细胞Notch2、hes-1、MCP-1蛋白表达下调（P<0.01）, HIF-1α蛋白上调（P<0.01）,提示CS可能是通过抑制肾IRI时Notch2/hes-1信号通路的活化,影响MCP-1、HIF-1α等炎症因子的转录,而实现肾保护作用。结论：1.肾IRI时IL-6、TNF-α、MCP-1和HIF-1α表达上调,证实肾IRI存在炎症和氧化应激过程。2.肾IRI诱导肾小管上皮细胞Notch2/hes-1信号通路活化,活化的Notch2/hes-1信号通路能调控IL-6、TNF-α、MCP-1和HIF-1α等的转录。3.冬虫夏草能减轻肾IRI时肾脏病理损伤,改善肾功能,有效抑制Notch2/hes-1信号通路的活化,下调IL-6、TNF-α、MCP-1等炎症因子的转录,上调肾小管上皮细胞HIF-1α的表达,证实冬虫夏草提取液通过影响Notch/hes-1信号通路而有效地抗炎、抗氧化作用,这可能是冬虫夏草新的肾保护作用机制。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词
• 前言
• 第一部分 炎症和氧化应激在肾缺血-再灌注的作用
• 第一节 体内实验----动物实验
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 第二节 体外实验-细胞实验
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 小结
• 第二部分 Notch2/hes-1信号通路活化调控肾I/R时IL-6、TNF-α、MCP-1和HIF-1α的表达
• 第一节 动物实验
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 第二节 体外实验
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 小结
• 第三部分 冬虫夏草对肾IRI时Notch信号通路-IL-6、TNF-α、MCP-1和HIF-1α表达的影响
• 第一节 动物实验
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 第二节 体外实验
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 小结
• 讨论
• 全文结论
• 附图
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间主要研究成果