细胞内钙—缝隙连接因子在针刺预治疗改善缺血性心律失常中的作用

论文摘要

冠心病心肌缺血是世界范围内死亡率最高的疾病之一。而缺血性心律失常,尤其是室性纤颤是大多数病例心脏停跳而猝死的原因。针刺可以改善缺血性心律失常,本研究室最近的工作表明,电针预处理能够抑制心肌缺血再灌注导致的心律失常。而有关针刺预处理抗缺血性心律失常的机制,迄今无人涉足。已知心肌细胞间存在缝隙连接,它是心肌细胞间通讯的主要结构,是由两个相邻的心肌细胞各出一个Cx共同组成一个共享通道,进而完成细胞间的通讯功能。Cx是一种跨膜蛋白,是缝隙连接的重要通道蛋白。最近几年有关缝隙连接及连接因子与心律失常关系的研究已经成为一个备受关注的国际性热点问题。研究证明,心肌缺血引起的心律失常,尤其是致命性的室速或心房纤颤与心室肌的Cx43的重塑,包括Cx43的数量减少、磷酸化状态的改变[磷酸化（激活状态）的Cx43数量减少,而非磷酸化的Cx43增多]以及重新分布有关。已知Cx43是一个钙相关的功能蛋白。而这种心肌缺血所致的Cx43的重塑可能与缺血时的细胞内钙超载有关。而心肌缺血时的钙超载,主要是由于缺血心肌内交感神经递质的释放增加,通过心肌细胞beta-肾上腺素受体的信号传导路径而引起。另外,在细胞内钙[Ca2+]i增加的同时,会出现钙振荡现象,而钙振荡与心律失常的发生有关。可见,心肌细胞内钙振荡和钙相关的Cx43乃是缺血性室性心律失常发生的关键点。最近几年有关缺血预处理的机制研究也逐步转移到缝隙连接及其连接因子方面。缺血预处理的保护作用可能与预处理使儿茶酚胺释放减少而降低细胞内钙,从而抑制缺血引起的Cx43去磷酸化和细胞内重新分布。另外,如前述,心肌缺血时由于交感神经兴奋、儿茶酚胺释放,经激动心肌beta-受体信号通路而导致钙超载。采用激动该信号通路不同站点（如采用异丙肾上腺素激动beta-受体、采用Forskolin激动腺苷酸环化酶以及采用细胞外高钙或钙通道激动剂打开钙通道）的方法都成功模拟了缺血预处理对心肌缺血的保护作用。由于针刺可以影响交感神经的功能,因此针刺预处理就极有可能通过心肌beta-受体及其受体后的传导通路,像缺血预处理一样,改善心肌细胞钙超载、进而改善钙相关的Cx43的重塑过程,包括Cx43的数量、磷酸化的程度以及Cx43重新分布,最终降低因缺血再灌注导致的心律失常。本项研究采用结扎和再灌大鼠左冠状动脉前降支的方法建立实验性心肌局部缺血模型和离体心脏模拟全心缺血（低灌流）模型,首先确定电针预处理对缺血性心律失常的疗效,并在此基础上探讨细胞内钙—缝隙连接因子Cx43在介导电针预治疗改善缺血性心律失常中的作用,为针刺改善缺血性心律失常提供分子水平的科学依据。此外,针刺预处理机制的阐明,也将有助于为采用针灸疗法防治该病开辟一条新的途径。实验选用雄性成年大鼠Sprague-Dawley（SD）130只,体重215±35g,随机分为正常对照组（NC组）、心肌缺血组（IR组）、电针预治疗+心肌缺血组（EA组）、电针预治疗+心肌缺血+Cx43拮抗剂18 beta-glycyrrhetinic acid（EAG）组以及电针预治疗+心肌缺血+钙通道激动剂Bay K8644（EAB）组。EA组于每次麻醉后电针内关30min（电针参数:强度1-3mA,频率2/15Hz变频）,连续三天;EAG组和EAB组分别于每次麻醉后先腹腔注射18 beta-glycyrrhetinic acid（160ug/kg）或Bay K8644（9.98ug/kg）,30min后再电针内关30min,连续三天。NC组、IR组仅于每次麻醉后捆绑30min,不做其他处理,连续三天。实验包括三部分内容:1电针预治疗对缺血性心律失常疗效的确定;2探讨心肌细胞内钙在电针预治疗改善心肌缺血性心律失常中的作用;3探讨缝隙连接因子Cx43重塑机制在电针预治疗改善心肌缺血性心律失常中的作用。具体结果如下:1电针预治疗对缺血性心律失常疗效的确定采用Cuitis’s Scoring System对各组的心律失常发生情况进行评定。NC组心律失常评分为0分,表明NC组在再灌注10min内没有心律失常发生;IR组于再灌注10min内出现了不同的房性和室性的心律失常,其评分为3.75±0.25,明显高于NC组（P＜0.05）;经电针治疗后,EA组评分为0.75±0.25,与IR组比较,其心律失常发生率明显下降（P＜0.05）。2心肌细胞内钙在电针预治疗改善心肌缺血性心律失常中的作用2.1电针预治疗对模拟全心缺血大鼠单个心肌细胞内静息钙水平的影响NC组单个心肌细胞内静息钙离子浓度均值是73.67±1.08 nmol/L,而IR组单个心肌细胞内静息钙离子浓度均值为110.42±1.49 nmol/L,明显高于NC组（P＜0.01）;EA组单个心肌细胞内静息钙离子浓度均值为85.42±1.56 nmol/L,与IR组比较,其钙离子浓度显著下降（P＜0.01）;而当每次电针预治疗前给予Cx43拮抗剂—18beta-glycyrrhetinic acid或者钙通道激动剂—Bay K8644时,EAG,EAB两组单个心肌细胞内静息钙离子浓度均值分别为110.42±1.64 nmol/L,110.833±1.41 nmol/L,均明显高于EA组（P＜0.01）,说明Cx43拮抗剂和钙通道激动剂均可以抑制电针预治疗的保护作用。2.2电针预治疗对模拟全心缺血大鼠单个心肌细胞静息状态下钙振荡的影响NC组单个心肌细胞发生钙振荡的次数为0次,表明NC组在静息状态下10min内没有钙振荡发生,而IR组于静息状态下10min内出现了较为频繁的钙振荡,其次数为43.83±2.68次,明显高于NC组（P＜0.01）;经电针预治疗后,EA组静息状态下发生钙振荡的次数明显下降,其次数为8.33±1.58次,明显低于IR组（P＜0.01）。而当每次电针预治疗前给予Cx43拮抗剂—18 beta-glycyrrhetinic acid或者钙通道激动剂—Bay K8644时,EAG组和EAB组于静息状态下发生钙振荡的次数分别为:34±2.11次和48.75±3.34次,此二组发生钙振荡的次数均显著高于EA组（P值均＜0.01）。其结果表明Cx43拮抗剂和钙通道激动剂均抑制了电针预治疗的保护作用。2.3电针预治疗对模拟全心缺血大鼠单个心肌细胞在电刺激下钙振荡的影响NC组单个心肌细胞在电刺激下10分钟内发生钙振荡的次数为0次,表明NC组单个心肌细胞可以在电场刺激下随着电刺激的频率有规律地收缩,没有钙振荡的发生。而IR组单个心肌细胞在电场刺激下出现了较为频繁的钙振荡,其次数为189.42±29.38次,明显高于NC组（P＜0.01）;经电针预治疗后,EA组单个心肌细胞在电场刺激下钙振荡的次数明显下降,其次数为10.08±3.09次,明显低于IR组（P＜0.01）。与静息状态下类似,当每次电针预治疗前给予Cx43拮抗剂—18 beta-glycyrrhetinic acid或者钙通道激动剂—Bay K8644时,EAG组和EAB组单个心肌细胞在电场刺激下亦出现了较为频繁的钙振荡,其次数分别为:125.25±17.24次和289.83±25.98次,均明显高于EA组（P值均＜0.01）。结果表明,18 beta-glycyrrhetinic acid和Bay K8644抑制了电针预治疗的保护作用。3缝隙连接因子Cx43重塑机制在电针预治疗改善心肌缺血性心律失常中的作用3.1电针预治疗对模拟全心缺血大鼠心肌细胞膜Cx43蛋白总含量的影响以NC组大鼠心肌细胞膜上Cx43蛋白总含量作为100%,得到的各组心肌细胞膜上Cx43蛋白总含量的百分比分别为:IR组82.25±0.02%,EA组83.99±0.02%,EAG组80.52±0.01%,EAB组86.14±0.01%,表明IR、EA、EAG和EAB各组与NC组比较Cx43蛋白总含量有所降低。而IR、EA、EAG和EAB各组大鼠心肌细胞膜上Cx43蛋白总含量无明显变化（P值均＞0.05）,表明Cx43蛋白含量没有参与介导针刺预治疗抗缺血性心律失常的作用。以下需要进一步分析Cx43磷酸化状态在介导针刺预治疗抗缺血性心律失常的作用。3.2电针预治疗对模拟全心缺血大鼠心肌细胞膜Cx43蛋白磷酸化状态的影响以NC组为100%进行比较,IR组非磷酸化的Cx43的含量的百分比为238±0.33%,明显高于NC组（P＜0.05）;其相应的磷酸化的Cx43的含量的百分比为42.26±0.03%,明显低于NC组（P＜0.05）,经电针预治疗后:EA组非磷酸化的Cx43的含量的百分比为108±0.06%,明显低于IR组（P＜0.05）;其相应的磷酸化的Cx43的含量的百分比为89.21±0.25%,明显高于IR组（P＜0.05）。而EAG组和EAB组与IR组情况类似,两组非磷酸化的Cx43的含量的百分比分别为:246±0.18%,253±0.16%,均明显高于EA组（P值均＜0.05）,此二组相应的磷酸化的Cx43的含量百分比分别为:39.26±0.01%和29.28±0.02%:均明显低于EA组（P值均＜0.05）。上述结果表明,电针预治疗可以减低缺血引起的非磷酸化的Cx43的含量的异常增高,增加相应的磷酸化的Cx43的含量,而预先给予Cx43拮抗剂和钙通道激动剂均可以抑制电针预治疗的保护作用。结论:电针预治疗具有抗缺血性心律失常的保护作用。它可能是通过抑制心肌细胞内钙超载、抑制钙振荡的发生,并改善钙相关的Cx43蛋白磷酸化的状态,最终降低缺血性心律失常的发生。

论文目录

• 摘要
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词表
• 文献综述
• 1 针刺预治疗在防治冠心病心肌缺血及缺血性心律失常中的意义
• 2 针刺预治疗对交感系统的影响及其与缺血预处理的相似性
• 3 针刺及其预处理改善心肌缺血及抗缺血性心律失常的机制
• 4 心律失常与电导特性
• 5 心律失常与缝隙连接
• 6 心律失常与细胞内钙
• 2+)生理'>6.1 钙离子(Ca²⁺)生理
• 6.2 钙离子在心律失常中的作用
• 7 心律失常机制探讨:细胞内钙-Cx43-心肌缝隙连接电导特性的作用
• 8 小结
• 前言
• 材料及方法
• 1 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要实验仪器
• 1.3 试剂
• 1.4 主要溶液的配制
• 2 方法
• 2.1 实验分组及预处理方法
• 2.2 大鼠心肌缺血模型的建立
• 2.3 大鼠心肌细胞的分离
• 2.4 大鼠心肌细胞负载荧光探针Fura-2/AM
• 2.5 检测指标
• 2.6 统计学处理
• 结果
• 1 电针预治疗改善大鼠缺血性心律失常疗效的确定（见图1）
• 2 心肌细胞内钙在电针预治疗改善缺血性心律失常中的作用
• 2.1 电针预治疗对模拟全心缺血大鼠单个心肌细胞内静息钙水平的影响（见图2）
• 2.2 电针预治疗对模拟全心缺血大鼠单个心肌细胞静息状态下钙振荡的影响（见图2A、图3）
• 2.3 电针预治疗对模拟全心缺血大鼠单个心肌细胞在电刺激下钙振荡的影响（见图4）
• 3 缝隙连接因子Cx43重塑机制在电针预治疗改善心肌缺血性心律失常中的作用
• 3.1 电针预治疗对模拟全心缺血大鼠心肌细胞膜Cx43蛋白总含量的影响（见图5）
• 3.2 电针预治疗对模拟全心缺血大鼠心肌细胞膜Cx43蛋白磷酸化状态的影响（见图6）
• 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历