论文摘要
目的：Livin是凋亡抑制蛋白（inhibitors of apoptosis proteins，IAPs）中的一个最新成员，其主要在基因转录过程中发挥重要的作用。降低或消除Livin基因在肿瘤细胞中的过度表达，可解除Livin对肿瘤细胞凋亡的抑制作用，促进肿瘤细胞死亡和增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。RNA干扰（RNAi）能高效特异地调低目的基因的表达，并已广泛应用于肿瘤治疗的研究。本研究旨在采用RNA干扰技术转染结肠癌SW480细胞，观察其对人结肠癌细胞株SW480增殖凋亡的影响，并初步探讨Livin基因在结肠癌中的作用，为进一步研究结肠癌的耐药性及基因治疗奠定基础。方法：①设计并制备针对Livin基因的小干扰RNA序列，以脂质体（lipofectamineTM2000）为载体转染具有高侵袭潜能低分化人结肠癌细胞株SW480，流式细胞仪检测其转染效率，寻求SW480细胞株的最佳转染效率的条件；②将Livin-siRNA转染人结肠癌细胞株SW480，分别采用RT-PCR以及Western印迹检测转染后SW480细胞Livin和Caspase-3在mRNA和蛋白水平表达情况；四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测不同时间段细胞增殖活性的变化，并绘制生长曲线。③采用流式细胞术（FCM）检测计算对照组和实验组细胞的吸光度值以及细胞周期，细胞凋亡的情况。结果：①细胞数约为每孔1.2×105个，siRNA为80pmol，Lipofectamine2000与siRNA比例为4ul:4ul（6孔板）时，具有较佳的转染效率（93.9%），继续提高siRNA浓度并不能明显提高转染效率；②转染Livin-siRNA后转染组Livin mRNA和蛋白表达明显下降，其差别具有统计学意义（p<0.05），显示出较佳的干扰效果；而Caspase-3mRNA的表达和蛋白的活性却得到增强，差别具有统计学意义（p<0.05）。③转染了Livin-siRNA的结肠癌细胞增殖能力下降，差别具有统计学意义（p<0.05），凋亡增加，差别具有统计学意义（p<0.05），但对其细胞周期未见明显影响，差别无统计学意义（p>0.05）。结论：①Livin-siRNA能有效沉默结肠癌细胞株SW480中Livin基因的过表达；②Livin基因通过Caspase蛋白酶水解途径来调控SW480细胞的生长；③Livin-siRNA转染可抑制结肠癌细胞株SW480的增殖并且能加速其凋亡，但可能不通过影响细胞周期来发挥作用。靶向RNAi干扰技术在结肠癌的基因治疗中具有潜在的价值，Livin可作为结肠癌基因治疗的新靶点。