斑马鱼POP3的OPEN法基因打靶及其相互作用基因的荧光报告系统分析

论文摘要

斑马鱼已经成为最受重视的脊椎动物发育生物学模式之一,但斑马鱼体内的基因打靶技术尚不成熟,不利于对斑马鱼基因的生物学功能进行深入研究。2008年国际上发展出一种新的斑马鱼基因敲除技术,即锌指核酸酶寡聚体库工程（Oligomerized pool engineering）进行基因敲除,简称OPEN法基因打靶技术。本文探索利用OPEN法基因打靶技术敲除斑马鱼POP3基因,以便进一步建立斑马鱼POP3基因敲除品系。本文通过ensembl信息库（http://www.ensembl.org/）查找到斑马鱼基因POP3基因位置,获得该基因外显子、内含子及开放阅读框信息,将POP3编码序列输入到ZiFiT软件中,通过“锌指核酸酶”资源库分析序列所有潜在的锌指蛋白靶位点,从中选择最合适的锌指蛋白靶位点。针对每个半位点,首先从文库中扩增出了单锌指蛋白（ZFP）,再通过PCR技术将三个单锌指蛋白编码序列有序的聚合在一起,构建包含所有组合的三联体锌指编码序列的大肠杆菌文库。利用OPEN技术,针对每个半位点筛选出活性较强的6个锌指蛋白序列,通过细菌双杂交（B2H）方法检测这些锌指蛋白对靶位点的特异结合能力较强。分析结果表明,本文已成功筛选出靶位点355bp处的2个半位点锌指蛋白,该锌指蛋白可作为斑马鱼体内基因打靶工具。另一方面,本文还用荧光报告系统分析了POP3与ATF4相互作用关系,以及二者在心脏发育中调控GATA4的情况。该研究是基于POP3基因的前期有关研究结果而进行的。前期实验表明POP3与ATF4存在相互作用。本文通过生物信息学分析GATA4启动子序列,发现人类GATA4转录起始位点上游-2000bp左右有一个保守的CRE类似位点。通过克隆技术获得了人类基因GATA4启动子序列质粒,利用荧光系统分析发现GATA4启动子上的CRE序列至关重要,POP3与ATF4通过GATA4启动子上的CRE序列激活GATA4的转录活性,从而在报告系统分析水平上证明POP3与ATF4相互作用,通过特异结合在GATA4启动子上的CRE转录位点来调控GATA4的表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言和文献综述
• 1.1 锌指核糖核酸酶技术概述
• 1.1.1 原理
• 1.1.2 锌指结构域
• 1.1.3 锌指核酸酶的设计
• 1.1.4 锌指核酸酶技术在实际中的应用
• 1.2 OPEN技术
• 1.3 真核生物中的基因转录调控
• 1.3.1 起始与调控
• 1.3.2 顺式作用元件
• 1.3.3 反式作用因子及其结构域
• 1.4 荧光报告系统在哺乳动物细胞中应用
• 1.5 POP家族在心脏发育中作用
• 1.6 本文研究的意义
• 第二章 斑马鱼POP3 OPEN法基因打靶
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 生物信息学软件
• 2.2.2 菌种和质粒
• 2.2.3 主要试剂及仪器
• 2.3 方法
• 2.3.1 引物设计与合成
• 2.3.2 DNA片段PAGE纯化方法
• 2.3.3 倍比稀释方法
• 2.3.4 化学感受态细胞的制备
• 2.3.5 电转化学感受态制备
• 2.3.6 电转化
• 2.3.7 高感染率辅助噬菌体M13K07制备
• 2.3.8 浓度梯度平板的制备方法
• 2.3.9 β-半乳糖苷酶分析B2H报告菌株实验方法
• 2.3.10 ZFNs打靶位点选择
• 2.3.11 构建B2H（大肠杆菌双杂交）筛选菌株
• 2.3.12 锌指文库构建
• 2.3.13 制备三指蛋白噬菌体文库
• 2.3.14 OPEN法筛选ZFPs
• 2.3.15 构建B2H报告菌株
• 2.3.16 用B2H检测OPEN法筛选所获三指序列的特异结合能力
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 斑马鱼基因POP3的打靶位点分析结果
• 2.4.2 B2H（大肠杆菌双杂交）筛选菌株构建结果
• 2.4.3 锌指库构建
• 2.4.4 利用OPEN法筛选锌指蛋白编码序列
• 2.4.5 B2H报告菌株构建
• 2.4.6 B2H分析ZFP靶位点结合活性
• 2.4.7 构建ZFP-Fokl融合表达质粒
• 第三章 斑马鱼POP3相互作用基因的荧光报告分析
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 生物信息学软件
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 质粒、细胞和菌株
• 3.2.4 主要实验仪器和耗材
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 PCR反应
• 3.3.2 PCR产物的纯化回收
• 3.3.3 产物与载体的连接
• 3.3.4 转化（热休克法）
• 3.3.5 质粒的小量制备
• 3.3.6 阳性克隆的筛选与鉴定
• 3.3.7 测序
• 3.3.8 真核表达重组质粒的大量制备
• 3.3.9 常规细胞培养
• 3.3.10 荧光素酶报告系统分析
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 GATA4启动子分析
• 3.4.2 POP3与ATF4相互作用调控GATA4的荧光报告分析结果
• 第四章 讨论
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 致谢