论文摘要
研究背景和目的转移是导致恶性肿瘤患者死亡的最主要原因之一。有效控制肿瘤转移就意味着显著改善肿瘤患者的生存期。临床上治疗恶性肿瘤的常规方法主要包括手术,化疗,放疗等。手术是早期恶性肿瘤患者的首选治疗手段。然而,大多数病人就诊时已不是早期,往往已经发生了远处转移。化疗是最常用的辅助治疗手段,能发挥清除手术残余病灶或转移灶的作用。化疗与手术联用,能较好的控制多种类型恶性肿瘤。但是,化疗药物会引起明显的全身性毒副作用和患者的不良反应。其次,多疗程的重复化疗容易引起肿瘤细胞的耐药性,抵抗化疗药物的作用。因此,人们试图制备克服化疗药物缺点的新型抗肿瘤药物。1906年,德国科学家第一次提出靶向治疗这个概念。其目的是提高病灶局部的药物浓度,减少毒副反应,降低用药量,使药物能安全有效的发挥作用。目前已经在临床治疗恶性肿瘤的分子靶向药物主要包括：单抗类分子靶向药物（贺赛汀）,单靶点酪氨酸激酶抑制剂（伊马替尼）,多靶点酪氨酸激酶抑制剂（索拉非尼）,融合毒素类靶向药物（ONTAK）。本研究通过基因工程技术制备了白喉毒素分子截短片段DT390与靶向肽TMTP1串联的两种融合毒素DT390-TMTP1和DT390-biTMTP1,并通过体内外实验探讨其对高转移潜能肿瘤细胞及肿瘤转移灶的作用,旨在为临床治疗肿瘤转移提供新策略。方法1. DT390-TMTP1和DT390-biTMTP1融合毒素的基因构建、表达及纯化（1）PCR扩增基因片段,酶切回收,插入到pET28a（+）表达载体,构建重组质粒pET28a（+）/DT390-TMTP1与pET28a（+）/DT390-biTMTP1。（2）按转化操作方法将重组质粒转入BL21（λDE3）感受态宿主细胞,IPTG诱导表达。（3）超声裂菌法提取包涵体,Ni-NTA His·Bind树脂亲和纯化,SDS-PAGE胶检测包涵体的量及纯度。（4）稀释复性法将包涵体复性,超滤管浓缩。（5）SWISS-MODEL分析DT390-TMTP1和DT390-biTMTP1融合蛋白的晶体结构。2.体外实验研究DT390-TMTP1和DT390-biTMTP1融合蛋白对肿瘤细胞和正常细胞的毒性作用（1）1-6μg/ml的DT390-TMTP1和DT390-biTMTP1融合蛋白分别作用于胃癌细胞MKN-45,前列腺癌细胞PC-3M-1E8及正常人胚肾细胞HEK293,24小时后通过MTT实验检测各浓度对细胞存活率的影响。（2）MTT法比较TMTP1肽、DT390-TMTP1和DT390-biTMTP1融合毒素对PC-3M-1E8,MKN-45,HEK293的细胞杀伤效应。（3）流式细胞术检测TMTP1肽、DT390-TMTP1和DT390-biTMTP1融合毒素作用后PC-3M-1E8,MKN-45及HEK293细胞的凋亡率。（4）普通光学显微镜下观察TMTP1, DT390-TMTP1及DT390-biTMTP1融合蛋白引起PC-3M-1E8,MKN-45及HEK293细胞形态学变化。（5）Confocol检测TMTP1, DT390-TMTP1及DT390-biTMTP1融合蛋白引起PC-3M-1E8, MKN-45及HEK293细胞核的变化。3. DT390-biTMTP1融合蛋白体内分布及肿瘤靶向治疗的体内研究（1）建立前列腺癌和胃癌皮下瘤模型。（2）前列腺癌和胃癌皮下瘤裸鼠分组经TMTP1肽、DT390-TMTP1和DT390-biTMTP1融合毒素处理,观察肿瘤大小及裸鼠生存率。（3）胃癌原位瘤裸鼠分组经TMTP1肽、DT390-TMTP1和DT390-biTMTP1融合毒素处理,观察原发灶及转移灶的发生率。（4）免疫组化检测DT390-biTMTP1融合蛋白在荷瘤裸鼠体内的分布与代谢。（5）免疫组化检测TMTP1肽、DT390-TMTP1和DT390-biTMTP1融合毒素处理的各组胃癌皮下瘤组织中细胞增殖（Ki67）与凋亡（Caspase3和TUNEL）指标的表达。结果1.成功构建了重组质粒pET28a（+）/DT390-TMTP1与pET28a（+）/DT390-biTMTP1。转入BL21感受态细胞后经IPTG诱导产生大量包涵体,超声裂解细菌释放包涵体,50% Ni-NTA His·Bind树脂纯化包涵体。经过稀释复性与超滤浓缩后,获得了一定量高纯度的融合蛋白。SWISS-MODEL分析结果显示白喉毒素的跨膜域及酶活性域与野生型白喉毒素分子的空间构象一致,理论上DT390-TMTP1和DT390-biTMTP1的导向部分和毒性部分都能正常发挥功能。2.MTT实验结果显示1-6μg/ml的TMTP1肽以及DT390-TMTP1融合蛋白不能有效抑制PC-3M-1E8,MKN-45及HEK293细胞的存活率,而DT390-biTMTPl融合蛋白高效杀伤PC-3M-1E8及MKN-45细胞,对HEK293细胞的存活率无影响。流式细胞术检测结果显示TMTP1肽与DT390-TMTP1融合毒素不能显著诱导PC-3M-1E8,MKN-45及HEK293细胞凋亡,但DT390-biTMTP1融合毒素引起PC-3M-1E8和MKN-45细胞剧烈凋亡,对HEK293细胞凋亡无影响。光学显微镜下观察结果显示TMTP1肽与DT390-TMTP1融合毒素没有引起PC-3M-1E8,MKN-45及HEK293细胞明显皱缩。但DT390-biTMTP1融合毒素引起PC-3M-1E8和MKN-45细胞大量皱缩,对HEK293细胞形态无影响。Confocol观察各组细胞核的形态。结果发现DT390-biTMTP1作用的PC-3M-1E8细胞发生了核碎裂,MKN-45细胞发生了明显核皱缩,而HEK293细胞核没有明显变化。TMTP1以及DT390-TMTP1处理的三种细胞核均没有发生明显改变。3.成功建立了前列腺癌/胃癌皮下瘤模型。荷瘤裸鼠经PBS, TMTP1, DT390-TMTP1以及DT390-biTMTP1融合毒素处理8次后,DT390-biTMTP1融合毒素显著抑制了PC-3M-1E8前列腺癌皮下瘤的生长并且显著延长了荷瘤裸鼠的生存期。而TMTP1及DT390-TMTP1融合毒素无明显治疗效果。同样,DT390-TMTP1融合毒素显著抑制了MKN-45胃癌皮下瘤的生长,而TMTP1及DT390-TMTP1对MKN-45胃癌皮下瘤的生长无明显影响。建立成功的胃癌原位模型的治疗结果显示PBS, TMTP1, DT390-TMTP1和DT390-biTMTP1融合蛋白处理组裸鼠胃原位均100%发生肿瘤,并且前3组裸鼠均发生了广泛的肝、脾、腹壁转移,而DT390-biTMTP1融合蛋白处理组裸鼠未发生肝脾转移。DT390-biTMTP1融合蛋白在荷瘤裸鼠体内的分布与代谢检测提示DT390-biTMTP1融合蛋白短时间（注射后1小时）内高浓度聚集到皮下瘤组织内,并且持续时间长（注射后48小时）。除了在肝脏（0.5-1小时）和肾脏（0.5小时）中一过性出现DT390-biTMTP1融合蛋白阳性表达外,脑组织,心脏组织,脾脏组织,肺组织中都没有出现阳性表达。免疫组化检测DT390-biTMTP1融合蛋白处理的皮下瘤组织中Ki67表达明显比对照组弱,而Caspase3和TUNEL染色比PBS对照组显著增强，提示DT390-biTMTP1融合蛋白通过抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞坏死发挥抑制裸鼠皮下瘤生长的作用。结论DT390-biTMTP1融合蛋白高效靶向杀伤高转移肿瘤及转移灶,提示其具备潜在的临床应用前景。