鹅副粘病毒E01株HN蛋白的表达及其相关免疫效果的初步研究

论文摘要

本研究主要将本实验室分离、鉴定并纯化的鹅源副粘病毒E01株进行了基因组RNA的提取,参考GenBank收录的ZJ1株鹅源副粘病毒全基因组核苷酸序列,在HN基因的ORF上下游设计1对特异性引物HNF1/HNR1,通过RT-PCR方法扩增得到HN基因片段。并将其连接至克隆载体pMD-18T上,得到克隆质粒,命名为T-HN。将编码HN蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列分别与13株国内外NDV毒株进行同源性比较,并绘制系统发育树。结果显示,同源性分别在65.7%-99.0%和84.6%-99.0%。属于基因Ⅶ型NDV。在HNF1/HNR1的5’端进行修饰,分别加入EcoRI和SalI限制性酶切位点得到用于扩增HN基因ORF的第二对引物HNF2/HNR2,以质粒T-HN为模板,PCR扩增得到用于原核表达的HN ORF片段,将其克隆至原核表达载体pET-32a上,构建了原核表达质粒pET-HN,并转化表达菌BL21（DE3）中,通过IPTG的诱导表达,将表达蛋白进行SDS-PAGE检测,用全病毒高免血清进行Western blot检测,出现特异性条带。依照相同方法重新修饰HNF1/HNR1的5’端,分别加入EcoRI和Not I限制性酶切位点得到用于扩增HN基因ORF的第三对引物HNF3/HNR3,以质粒T-HN为模板,PCR扩增得到用于真核表达的HN ORF片段,将其克隆至真核表达载体pVAXl上’构建了真核表达质粒pVAX-HN,将其转染Vero田胞72h后,进行间接免疫荧光试验,出现特异性绿色荧光,提取阳性转染细胞总RNA,进行RT-PCR扩增,可见一条大小约1.7kb的条带,说明真核表达质粒能够表达HN蛋白。GPMV HN蛋白在原核和真核系统中的成功表达为高效的亚单位基因工程疫苗的研制、新型诊断方法的建立及鹅源副粘病毒基因融合功能的研究奠定基础。为验证HN蛋白与HN基因的DNA疫苗pVAX-HN的免疫效果,本研究还将原核表达的HN蛋白复性产物与重组质粒pVAX-HN同时免疫7日龄SPF鸡,每次免疫前采血,用间接ELISA测定血清中抗体水平。同时设生理盐水对照组和pVAXl空质粒对照组为阴性对照组,减毒活疫苗Lasota为阳性对照组。试验结果表明,两个免疫组三次免疫后产生的血清抗体显著高于阴性对照组。说明表达产物及DNA疫苗能够刺激机体免疫系统产生免疫反应,该项结果为后续制备鹅源新城疫基因工程疫苗奠定了基础。

论文目录

摘要

ABSTRACT

英文缩写词表

第一篇文献综述

第一章动物副粘病毒病的国内外研究进展

1 动物副粘病毒病概述

1.1 禽副粘病毒病的发展史

1.2 其它副粘病毒病的发展史

1.3 鹅副粘病毒病研究现状

2 NDV HN蛋白概述

2.1 NDV HN蛋白的结构特点

2.2 NDV HN蛋白的基本性质功能

3 GPMV E01株研究进展

4 NDV疫苗研究进展

4.1 灭活疫苗

4.2 活疫苗

4.3 基因工程疫苗

5 DNA疫苗

5.1 DNA疫苗的研究历史

5.2 AMPVI病的DNA疫苗研究现状

6 研究目的及意义

参考文献

第二篇实验部分

第二章鹅副粘病毒E01株HN蛋白基因的克隆及序列分析

摘要

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 RT-PCR扩增结果

2.2 酶切鉴定结果

2.3 序列测定及分析

3 讨论

4 小结

参考文献

ABSTRACT

第三章鹅副粘病毒E01株HN蛋白的原核表达

摘要

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 HN基因的扩增

2.2 HN基因重组原核表达载体的鉴定

2.3 HN蛋白时间梯度诱导表达分析

2.4 表达蛋白存在位置

2.5 Western blot检测结果

3 讨论

4 小结

参考文献

ABSTRACT

第四章鹅副粘病毒E01株HN基因真核表达载体的构建及其在vero细胞中的瞬时表达

摘要

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 HN基因重组真核表达载体的鉴定

2.2 间接免疫荧光结果

2.3 RT-PCR反应结果

3 讨论

4 小结

参考文献

ABSTRACT

第五章鹅副粘病毒E01株HN基因DNA疫苗与HN蛋白免疫效果的初步研究

摘要

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 新城疫病毒特异的血清IgG抗体的ELISA检测结果

3 讨论

4 小结

参考文献

ABSTRACT

全文总结

附录

致谢

鹅副粘病毒E01株HN蛋白的表达及其相关免疫效果的初步研究

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